《European Journal of Medicinal Chemistry》：Synthesis of Novel β-Boswellic Acid Amino Acid Conjugates in Targeting KRASG13D Mutant Colon Cancer
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本研究通过合成β-没药酸-氨基酸共轭物，发现含脲基连器的化合物8b具有显著提高的水溶性、细胞摄取和抗肿瘤活性，其IC50值分别为1.95±0.71μM和2.16±1.06μM，较游离酸提升10倍以上。机制研究表明8b通过抑制CDK6（IC50=703nM）和TWIST1通路诱导G1期阻滞及细胞衰老，同时分子对接和模拟证实与KRAS G13D蛋白及CDK6存在稳定结合，体内实验显示对KRAS突变型结直肠癌模型抑制率达89.58%，且系统毒性低。该成果为天然产物靶向治疗KRAS突变肿瘤提供了新策略。
Arem Qayum|Simmi Sharma|Syed Mohmad Shah|Sourav Kumar|Mohamad Sakib Abdullah|Mubashir Javed Mintoo|Anjna Sharma|Utpal Nandi|Naiem Ahmed Wani|Rajkishor Rai|Shashank Kumar Singh|Bhahwal Ali Shah
印度贾穆-180001，CSIR-印度综合医学研究所，癌症药理学部门
摘要
本文描述了一系列β-乳香酸-氨基酸 conjugates的合成及其细胞毒性评估，旨在提高抗癌效果，重点关注KRASG13D突变型结直肠癌（CRC）细胞。其中，化合物8b含有亲水性脲连接基团，显著提高了水溶性、细胞摄取能力和细胞毒性。体外实验表明，8b的IC50值分别为1.95±0.71μM（HCT-116G13D）和2.16±1.06 μM（HCT-15G13D），而β-乳香酸的IC50值大于25 μM。8b在两种细胞系中均诱导了G1期细胞周期停滞、癌基因诱导的衰老以及线粒体膜去极化。机制研究表明，8b选择性地抑制了CDK6（IC50 = 703 nM）并下调了TWIST1，这两种因子是肿瘤进展和药物耐受性的关键介质。分子对接和MD模拟证实了8b与CDK6和KRASG13D蛋白之间存在强而稳定的相互作用。在体内实验中，8b在多种小鼠模型中显著抑制了肿瘤生长（EAC模型中肿瘤生长抑制率高达89.58%），同时具有较低的全身毒性和良好的药代动力学参数。
引言
乳香酸是一类从乳香属植物树脂中提取的五环三萜类化合物，因其具有显著的抗炎、抗关节炎、抗哮喘和胃保护作用而受到广泛关注。近期药理学研究重点探讨了乳香酸（尤其是β-乳香酸）的抗癌潜力，因为它们能够调节多种与癌症发生相关的细胞内靶点和信号通路。然而，由于乳香酸的水溶性差和细胞渗透性有限（这些特性在许多疏水性天然产物中普遍存在），其临床应用受到极大限制。这些物理化学特性阻碍了有效的细胞内递送，降低了生物利用度，并可能导致脱靶效应和剂量限制性毒性。解决这些问题对于开发基于乳香酸的治疗药物至关重要。一种克服这一挑战的方法是将乳香酸与氨基酸结合。氨基酸具有不同极性和电荷的侧链，可以促进跨细胞膜的被动或主动运输，提高水溶性，并实现与细胞内生物分子的靶向相互作用。过去十年中，人们越来越关注利用氨基酸结合策略来改善天然和合成分子的药代动力学和药效学特性，特别是在前药设计和先进药物递送系统方面。多项研究表明，氨基酸或肽的结合可以增强治疗化合物的选择性、稳定性、生物利用度和细胞摄取能力，从而提升其治疗效果。
基于这些考虑，作为我们从天然产物中筛选生物活性先导化合物的持续努力的一部分，我们合成了一系列β-乳香酸-氨基酸 conjugates，主要目的是提高它们的抗癌潜力。最初的合成方法采用酯-酰胺连接方式，虽然表现出一定的抗增殖活性，但受限于较差的水溶性和细胞摄取能力。为了解决这些问题，我们引入了亲水性脲连接基团，得到了化合物8b（图1），其水溶性和细胞毒性得到了显著提升，这一点通过HCT-116和HCT-15结肠癌细胞系中的IC50值得到了验证。HCT-116和HCT-15细胞系携带KRASG13D突变，这是一种已知会导致对传统KRAS靶向疗法产生抗性的致癌驱动因子。机制研究表明，8b可诱导细胞衰老，表现为细胞形态扁平化和增大，以及明显的G1期细胞周期停滞。值得注意的是，8b还能抑制CDK6及其下游效应因子TWIST1，这两种因子都与肿瘤进展和治疗抵抗性相关。8b在突变KRAS细胞中同时抑制CDK6/TWIST1的效果类似于基因共缺失的效果，这突显了乳香酸 conjugates与KRAS驱动癌症中异常细胞周期调控途径之间的协同杀伤作用。8b能够选择性靶向致癌信号通路并促进细胞衰老，这表明其作为低毒性的靶向治疗剂具有巨大潜力。此外，由于其氨基酸结合的特性，其良好的药理学特性进一步说明了此类分子修饰在优化天然产物基药物候选物方面的广泛应用前景。
结果与讨论
- i) β-乳香酸-氨基酸 conjugates的合成及其活性的研究：我们首先将化合物1在氮气保护下用草酰氯处理转化为酸氯（方案1a）。所得酸氯与氨基酸的甲酯反应，生成相应的产物3a-g，产率在80-90%之间。类似的方法也被用于合成化合物3h，只是使用2-氨基乙酰胺代替了氨基酸。
8b的抗癌活性评估
- a) 8b对HCT-116和HCT-15细胞表型特征的影响：如图2所示，研究了化合物8b对HCT-116G13D和HCT-15G13D结直肠癌细胞的形态和细胞骨架组织的影响。未经处理的对照细胞以及HCT-116和HCT-15细胞中，细胞群体分布均匀（黄色箭头指示），显示出典型的上皮细胞形态和紧密的细胞间粘附及完整的细胞结构。相比之下，
结论
综上所述，β-乳香酸-氨基酸 conjugates，尤其是化合物8b，在体外和体内实验中均显示出对KRASG13D突变型结直肠癌的显著疗效。该化合物通过抑制CDK6/TWIST1诱导细胞衰老，为克服结直肠肿瘤的耐药性提供了有希望的途径。这些发现验证了氨基酸结合作为改善天然三萜类化合物药理和物理化学性质的可行策略。
材料与方法
化合物3a-h和4a-g的合成步骤：将化合物1（498 mg，1 mmol）置于干燥的DCM中，加入草酰氯（2 mL，20 mmol），在N2环境下于0℃下持续搅拌2小时。室温下继续搅拌2小时后，浓缩反应混合物，然后加入氨基酸的甲酯（1.2 mmol）和Et3N（0.85 mL，6 mmol），再次搅拌过夜。反应完成后，蒸发DCM并分离粗产物。
作者贡献声明
Arem Qayum：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据分析、概念构思。
Bhahwal Ali Shah：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、项目监督、方法学设计、资金申请、数据分析、概念构思。
Rajkishor Rai：方法学设计、实验研究。
Naiem Ahmed Wani：方法学研究。
Shashank Kumar Singh：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化。
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了印度科学与工业研究委员会（CSIR）和新德里印度医学研究委员会（ICMR）的支持，项目编号为2020-0112。
