对74个微单倍型进行的大规模并行测序，用于研究美国人群中的遗传关系

《Forensic Science International: Digital Investigation》：Massively parallel sequencing of 74 microhaplotypes for relationship testing in U.S. populations

本研究评估了74-locus Ion AmpliSeq? MH面板在四种美国人群（非裔、欧裔、西南裔、东亚裔）中用于近亲关系测试的性能，并与29-STR片段分析对比。结果显示MH在亲子鉴定和全同胞检测中LR值显著高于STR（>20），但对半同胞和堂表亲存在重叠，需更大面板（≥200 loci）提升远亲分辨率。该技术可增强混合样本解析和祖先推断能力。

　　在现代法医学研究中，微小基因型（Microhaplotypes, MHs）正逐渐成为一种重要的生物标记物。这些标记物因其低突变率、无 stutter 艺术品（即扩增过程中产生的非特异性片段）以及与大规模并行测序（Massively Parallel Sequencing, MPS）技术的高度兼容性而受到关注。随着法医学领域对高精度遗传信息需求的增加，MHs 在人类个体识别、混合样本解析、族谱预测以及亲属关系检测等方面展现出广阔的应用前景。

传统的 STR（短串联重复序列）标记物一直是法医学中用于人类识别（HID）和亲属关系检测的主要工具。STRs 的高多态性使其在区分紧密亲属关系（如父母与子女、兄弟姐妹）方面具有较高的准确性和可解释性。然而，STRs 在某些复杂场景中表现出一定的局限性，例如在混合样本或降解样本中，其突变率较高，容易产生 stutter 艺术品，这些因素可能影响其在解析远亲关系（如表亲、堂亲）时的可靠性。此外，STRs 在处理大规模数据集时，往往需要较高的 DNA 质量和数量，这在实际应用中可能带来一定的挑战。

随着 MPS 技术的发展，研究者们开始探索新的遗传标记物，以克服 STRs 的上述限制。MHs 作为一种新型的短基因组序列，通常长度在 300 个碱基对以下，能够包含两个或多个单核苷酸多态性（SNPs）。这种特性使得 MHs 在某些方面比传统的 STRs 更具优势。首先，MHs 的突变率较低，能够减少遗传信息在不同个体间的随机差异。其次，由于其长度较短，MHs 在扩增过程中不易产生 stutter 艺术品，从而提高了测序的准确性。更重要的是，MHs 能够通过 MPS 技术高效地进行测序，这使得它们在混合样本解析方面表现出更高的潜力。

尽管 SNP 微阵列已经被用于亲属关系检测，如法医调查基因谱（Forensic Investigative Genetic Genealogy, FIGG），但它们通常需要高质量和高数量的 DNA，且在混合样本中表现不佳。相比之下，MHs 的短扩增子特性使其在处理混合样本时更加高效，能够更准确地解析不同个体之间的遗传关系。此外，MHs 的多等位基因特性使其在信息量和区分能力方面优于单独的 SNP 标记物，从而在复杂亲属关系检测中展现出更高的适用性。

近年来，研究者们开发了多种针对亲属关系检测优化的 MH 试剂盒。例如，Wu 等人 [32] 测试了一种包含 54 个高度变异 MH 位点的试剂盒，该试剂盒在解析第一度亲属关系（如父母与子女）方面表现出良好的效果。然而，他们也指出，为了可靠地解析第二度和第三度亲属关系（如兄弟姐妹、表亲），需要更大的 MH 位点集合，大约 200 个高杂合度 MHs。类似地，Staadig 等人 [38] 在瑞典人群中评估了一种包含 45 个 MH 位点的 QIAseq 试剂盒，发现其在父权和全兄弟姐妹检测中表现优异，但在区分半兄弟姐妹和非亲属个体时，存在一定的 LR 分布重叠，这可能影响其在某些情况下的可靠性。

此外，Ma 等人 [39] 开发并测试了一种包含 45 个 X 连锁 MH 位点的试剂盒，该试剂盒在区分第二度亲属关系（如兄弟姐妹、表亲）方面表现出 70% 到 80% 的准确率。这一研究强调了非常染色体 MHs 在复杂亲属关系检测中的潜在应用价值。另一项研究则开发了一种包含 30 个 MHs 的非二元 SNP 基础试剂盒，该试剂盒在父权检测和全兄弟姐妹检测中表现出良好的效果。

Gao 等人 [41] 进一步开发了一种包含 232 个常染色体 MH 位点的试剂盒，专门用于亲属关系检测，即 FGID Microhaplotype Kit。该试剂盒在解析父母与子女、全兄弟姐妹、半兄弟姐妹以及表亲等不同亲属关系时，相较于传统的 CE-STR 试剂盒，表现出更高的 LR 值。这表明，随着 MHs 的不断发展，其在法医学领域的应用潜力正在逐步扩大。

在本研究中，我们对 Ion AmpliSeq? MH-74 Plex Panel 进行了全面的性能评估，该试剂盒在四个主要的美国人口群体中使用了 372 个家庭样本。这些样本包括三元组、四人组和六人组，覆盖了非洲裔美国人（AA）、欧洲裔美国人（EA）、西南裔美国人（HIS）和东亚裔美国人（EAA）等不同人群。我们还对 74plex MH 试剂盒与 29 个 STR 位点的检测性能进行了直接比较，分析了其在不同亲属关系场景中的表现。

通过对 Familias 软件的使用，我们评估了 MH 试剂盒在区分紧密亲属和远亲关系方面的能力。在父母与子女的检测中，MHs 和 STRs 均能有效区分，但 MHs 表现出更高的 LR 值，且其分布更加紧密，显示出更强的区分能力。在全兄弟姐妹的检测中，MHs 也表现优于 STRs，其 LR 值更高，表明其在解析这种关系时具有更高的准确性。然而，在半兄弟姐妹与非亲属个体的区分上，两种标记物均表现出一定的重叠，尽管 MHs 的 LR 值仍高于 STRs。在表亲的检测中，无论是 74 个 MHs 还是 29 个 STRs，均无法有效区分，显示出广泛的重叠和 LR 值接近或低于零的情况。

这些结果表明，尽管 74 个 MHs 在解析紧密亲属关系（尤其是第一度亲属关系）方面表现出色，但在处理更远的亲属关系（如表亲）时仍存在一定的局限性。这提示我们，为了可靠地解析更远的亲属关系，需要更大的 MH 位点集合，至少达到 200 个位点。此外，MHs 在混合样本解析、族谱预测以及亲属关系检测中的应用潜力正在逐步扩大，这使得它们成为法医学领域中一种重要的补充工具。

在实际应用中，MHs 的短扩增子特性使其在处理混合样本时更加高效，能够更准确地解析不同个体之间的遗传关系。相比之下，传统的 STRs 在处理混合样本时效果不佳，因为它们的长扩增子容易产生 stutter 艺术品，影响其在混合样本中的可靠性。因此，MHs 在混合样本解析方面的优势使其在法医学中具有重要的应用价值。

此外，MHs 的多等位基因特性使其在信息量和区分能力方面优于单独的 SNP 标记物。这种特性使得 MHs 在解析复杂亲属关系时能够提供更多的遗传信息，从而提高检测的准确性。然而，在某些情况下，如表亲的检测，MHs 仍然无法提供足够的区分能力，这可能与其位点数量有关。因此，为了提高 MHs 在解析远亲关系时的可靠性，需要进一步扩大位点数量，并进行更精细的优化。

综上所述，本研究支持了 74-MH AmpliSeq? 试剂盒在法医学亲属关系检测中的应用价值。尽管该试剂盒最初是为族谱预测和混合样本解析而设计的，但在实际应用中，它在解析第一度和第二度亲属关系方面表现出更高的准确性和可解释性。随着 MHs 技术的不断发展，其在法医学领域的应用前景将更加广阔，特别是在处理混合样本和远亲关系时。因此，进一步的研究应集中在开发更大、更精细的 MH 位点集合，以提高其在法医学中的适用性和可靠性。