通过骨靶向双膦酸盐修饰的PLGA纳米颗粒精确靶向METTL3，通过m6A-PPARα的相互作用在铁死亡调控中减轻骨质疏松症导致的骨丢失

《Free Radical Biology and Medicine》：Precision Targeting of METTL3 via Bone-Homing Bisphosphonate-Modified PLGA Nanoparticles Mitigates Osteoporotic Bone Loss through m6A-PPARα Crosstalk in Ferroptotic Regulation

骨质疏松的骨代谢调控机制及纳米药物递送研究。采用骨靶向聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒递送METTL3抑制剂，通过调控m6A-PPARα轴抑制铁死亡，改善BMSC功能，显著提升骨质疏松小鼠的骨密度和骨结构。

　　随着全球老龄化趋势的加剧，与年龄相关的骨质疏松症（Osteoporosis, OP）已成为重要的公共卫生问题，特别是在老年人群体中，骨折的发生率显著上升。世界卫生组织（WHO）指出，骨质疏松症是老年人骨折的主要原因，严重威胁着他们的生活质量。骨质疏松症的主要特征是骨密度降低和骨质脆弱，使得髋部、脊柱和手腕等关键部位的骨折风险增加。尽管目前的药物治疗，如双膦酸盐和雌激素替代疗法，能够在一定程度上延缓疾病的发展，但它们往往无法完全逆转骨组织的病理变化。因此，开发新的治疗策略，尤其是针对骨组织的靶向治疗，已成为骨质疏松症研究的重点方向。

骨质疏松症的进展与骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, BMSCs）功能的衰退密切相关。BMSCs是多种细胞谱系的前体细胞，包括成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞，并在骨重塑和再生过程中发挥基础性作用。随着年龄的增长，BMSCs的增殖和分化能力逐渐减弱，导致骨修复功能受损，从而加速骨质疏松症的发展。近年来的研究表明，铁死亡（Ferroptosis）是导致BMSC功能障碍的重要机制之一。铁死亡是一种由细胞内铁过载和脂质过氧化引起的受调控的细胞死亡方式，已被发现与多种病理状态相关。在骨代谢过程中，铁死亡破坏了BMSC的生存和分化，进而促进骨质疏松症的发生。因此，抑制铁死亡可能为骨质疏松症的治疗提供一种新的思路。

除了铁死亡，N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine, m⁶A）甲基化也被认为是骨代谢的重要调控机制之一。m⁶A是真核细胞中最丰富的内源性RNA修饰之一，通过影响RNA的稳定性、剪接、翻译和降解，调控多种生物学过程。越来越多的证据表明，m⁶A修饰在干细胞的增殖和分化中起着关键作用，特别是在BMSCs中。在BMSCs中，m⁶A修饰通过调控细胞命运决定和骨代谢相关基因的表达，影响骨形成和修复。甲基转移酶样3（Methyltransferase Like 3, METTL3）是m⁶A甲基化过程中的关键酶，催化RNA的m⁶A修饰。已有研究表明，METTL3通过调控铁死亡通路影响BMSC的生存和功能，这为基于m⁶A调控的新型治疗策略提供了理论基础。

目前，骨质疏松症的治疗手段仍然有限，传统的药物治疗存在诸多不足。双膦酸盐作为常用的抗吸收药物，能够有效减少骨吸收，但其作用机制主要针对破骨细胞介导的吸收过程，而非促进骨形成。长期使用双膦酸盐常伴随不良反应，如食道刺激和肾功能损害。因此，近年来靶向递送方法成为研究的热点。聚合物纳米颗粒（Polymeric Nanoparticles, PNPs）因其良好的生物相容性、可控的释放动力学和强的靶向能力，被广泛用于药物递送领域。双膦酸盐修饰的PLGA纳米颗粒（BP-PLGA）能够通过其对骨组织的亲和力实现靶向递送，从而增强治疗效果并减少药物相关的副作用。将这种技术应用于METTL3的靶向递送，有望通过调控m⁶A甲基化和铁死亡通路，有效干预骨质疏松症的发展。

尽管BP-PLGA纳米颗粒已被广泛研究作为有效的骨靶向递送平台，并成功应用于递送小干扰RNA（siRNA）或反义寡核苷酸等核酸药物，以调控骨代谢相关基因的表达，但本研究引入了一种创新性的应用，即将BP-PLGA纳米颗粒用于递送功能性m⁶A甲基转移酶METTL3的mRNA。这一方法代表了在载货类型和作用机制上的根本性进步。本研究的主要目标是开发BP-PLGA纳米颗粒用于METTL3的靶向递送，通过调控PPARα介导的m⁶A甲基化并抑制BMSCs中的铁死亡，从而治疗与年龄相关的骨质疏松症。通过体外和体内实验，我们验证了该系统在增强BMSCs的存活、增殖和成骨分化能力方面的治疗效果，同时改善了骨密度和骨结构的完整性。实验结果表明，BP-PLGA介导的METTL3递送显著抑制了铁死亡，促进了BMSCs的成骨能力，从而改善了骨质疏松症的病理特征。本研究为治疗与年龄相关的骨质疏松症提供了一种新的纳米治疗策略，并为铁死亡与m⁶A甲基化在骨代谢中的相互作用提供了关键的实验依据，具有重要的科学和临床意义。

在本研究中，我们设计了一种骨靶向的双膦酸盐修饰的PLGA纳米颗粒（BP-PLGA），用于递送METTL3抑制剂STM2457。为了评估这些纳米颗粒的性能，我们对其进行了粒径、电位和药物载量的表征。体外实验中，我们通过流式细胞术、Western blotting和qRT-PCR分析了METTL3抑制对衰老BMSCs中铁死亡和成骨分化的影响。体内实验中，我们建立了骨质疏松小鼠模型，并通过微CT、组织学分析和分子检测评估了纳米颗粒介导的METTL3抑制在治疗骨质疏松症中的效果。实验结果表明，骨靶向的BP-PLGA纳米颗粒在靶向衰老BMSCs和STM2457的持续释放方面表现出高效率。体外实验显示，METTL3的抑制能够逆转PPARα mRNA的m⁶A过度甲基化，恢复PPARα的表达，并减轻衰老BMSCs中的铁死亡，从而促进成骨分化。体内实验进一步证实，纳米颗粒治疗显著提高了骨密度，缓解了骨质疏松小鼠的骨退化，减少了骨髓脂肪化，并抑制了与铁死亡相关的标志物。从机制上看，METTL3与PPARα的相互作用通过调控脂质过氧化和YAP/TAZ信号通路影响铁死亡BMSCs的功能。本研究表明，通过骨靶向的BP-PLGA纳米颗粒精准靶向METTL3，可以利用m⁶A-PPARα轴在铁死亡调控中缓解骨质疏松症的骨丢失，为骨质疏松症的治疗提供了一种有前景的纳米治疗策略。

在实验方法上，我们首先制备了BP-PLGA@METTL3纳米颗粒。PLGA（Sigma-Aldrich, P2191）溶解在二氯甲烷（DCM）中，浓度为10 mg/mL，形成有机相。METTL3 mRNA和人血清白蛋白（HSA, Sigma-Aldrich, A1653, 5 mg/mL）溶解在磷酸盐缓冲液（PBS）中，形成水相。随后，将水相逐滴加入有机相中，并使用Ultra-Turrax T25均质器在8000 rpm下均质5分钟，获得初级乳剂。接着，使用Branson 450超声探头对乳剂进行进一步超声处理，以确保纳米颗粒的均匀性和稳定性。通过动态光散射（DLS）分析，我们发现BP-PLGA纳米颗粒的平均粒径约为206.9 nm，且分布范围较窄，表明其具有良好的物理特性。此外，我们还评估了纳米颗粒的稳定性，确保其在体内环境中的有效性和安全性。

为了进一步验证BP-PLGA@METTL3纳米颗粒的性能，我们进行了体外和体内实验。在体外实验中，我们通过流式细胞术检测了METTL3抑制对衰老BMSCs中铁死亡的影响。结果表明，METTL3的抑制能够显著减少铁死亡的发生，提高BMSCs的存活率。同时，我们通过Western blotting和qRT-PCR分析了PPARα的表达变化，发现METTL3的抑制能够逆转PPARα mRNA的m⁶A过度甲基化，恢复PPARα的表达水平。这进一步支持了METTL3与PPARα之间的调控关系，并表明其在骨代谢中的重要作用。在体内实验中，我们建立了骨质疏松小鼠模型，并通过微CT分析了骨密度的变化。结果显示，BP-PLGA@METTL3纳米颗粒治疗显著提高了骨密度，改善了骨结构的完整性。此外，我们还进行了组织学分析，发现纳米颗粒治疗能够缓解骨质疏松小鼠的骨退化，并减少骨髓脂肪化。这些结果表明，该纳米颗粒系统在治疗骨质疏松症方面具有良好的效果。

在分子机制方面，我们探讨了METTL3与PPARα之间的相互作用如何调控铁死亡BMSCs的功能。通过基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析，我们发现体外和体内实验数据在脂质代谢和PPAR信号通路方面具有高度一致性。这些分析进一步支持了METTL3与PPARα之间的调控关系，并表明其在骨代谢中的关键作用。此外，我们还发现METTL3的抑制能够显著减少与铁死亡相关的标志物，如脂质过氧化产物和铁离子水平，从而改善BMSCs的生存和分化能力。这些结果表明，METTL3与PPARα之间的相互作用在调控铁死亡和骨代谢中起着重要作用，为开发基于m⁶A调控的新型治疗策略提供了理论依据。

在本研究中，我们还探讨了BP-PLGA纳米颗粒的制备和稳定性。通过溶剂蒸发法，我们成功制备了BP-PLGA纳米颗粒。PLGA溶解在DCM中，随后加入双膦酸盐溶液，经过充分混合和溶剂去除，得到BP-PLGA纳米颗粒。为了去除未反应的双膦酸盐，我们将悬浮液在双膦酸盐溶液中搅拌24小时，并通过透析去除残留的双膦酸盐。通过DLS分析，我们发现BP-PLGA纳米颗粒的平均粒径约为206.9 nm，且分布范围较窄，表明其具有良好的物理特性。此外，我们还评估了纳米颗粒的稳定性，确保其在体内环境中的有效性和安全性。这些结果表明，BP-PLGA纳米颗粒不仅能够实现高效的骨靶向递送，还能够在体内保持较长的释放时间，从而增强治疗效果。

在讨论部分，我们进一步探讨了BP-PLGA@METTL3纳米颗粒在治疗骨质疏松症中的潜力。与传统治疗策略相比，虽然在蛋白质组学分析中识别出的差异表达蛋白（DEPs）数量有限，但GO和KEGG富集分析结果与转录组学数据高度一致，进一步支持了该策略的有效性。这些分析显示，脂质代谢和PPAR信号通路在该治疗策略中具有显著的富集，表明其在调控骨代谢和铁死亡中的关键作用。此外，我们还发现该纳米颗粒系统能够显著改善骨质疏松症小鼠的病理特征，包括骨密度、骨结构和骨髓脂肪化。这些结果表明，BP-PLGA@METTL3纳米颗粒在治疗骨质疏松症方面具有良好的应用前景。

在结论部分，我们总结了本研究的主要发现。本研究成功开发了BP-PLGA@METTL3纳米颗粒，实现了对骨组织的靶向递送，并通过调控PPARα介导的m⁶A甲基化和抑制BMSCs中的铁死亡，有效治疗了与年龄相关的骨质疏松症。体内实验结果表明，BP-PLGA@METTL3纳米颗粒能够显著改善骨质疏松症小鼠的骨组织结构，恢复正常的骨架构，并缓解其症状。这些结果不仅为骨质疏松症的治疗提供了一种新的纳米治疗策略，还为铁死亡与m⁶A甲基化在骨代谢中的相互作用提供了关键的实验依据，具有重要的科学和临床意义。

本研究的成果表明，通过靶向递送METTL3，可以有效调控骨代谢相关通路，从而缓解骨质疏松症的病理发展。BP-PLGA纳米颗粒的制备和优化为实现这一目标提供了技术基础，而其在体外和体内的表现则验证了该策略的可行性。未来的研究可以进一步探索该纳米颗粒系统在不同疾病模型中的应用，并评估其在临床治疗中的潜力。此外，还可以通过优化纳米颗粒的表面修饰和载药能力，提高其在骨组织中的靶向效率和治疗效果。这些研究将有助于推动骨质疏松症的精准治疗，并为相关疾病的研究提供新的思路和方法。

综上所述，本研究通过开发一种新型的纳米治疗策略，为骨质疏松症的治疗提供了重要的科学依据。BP-PLGA@METTL3纳米颗粒不仅能够实现高效的骨靶向递送，还能够通过调控m⁶A甲基化和铁死亡通路，改善BMSCs的功能，从而缓解骨质疏松症的病理特征。这一研究结果表明，基于m⁶A调控的纳米治疗策略在治疗与年龄相关的骨质疏松症中具有广阔的应用前景，并为相关疾病的治疗提供了新的思路和方法。