隐匿性乙型肝炎病毒前S区突变的潜在致癌作用：Akt/mTOR/cyclin D1信号通路的激活会引发细胞周期失调，并促进肝细胞癌的发生

《General and Comparative Endocrinology》：Potential oncogenic role of occult hepatitis B virus pre-S mutations: Activation of Akt/mTOR/cyclin D1 signaling drives cell cycle dysregulation and proliferation in hepatocellular carcinogenesis

本研究系统探究了OBI患者血液中高频率pre-S点突变对细胞增殖及肝细胞癌发生的影响，发现E39K、D44N、N98T、H128R和I161T突变通过激活Akt/mTOR通路及上调Cyclin D1促进G1/S期转换，其中LHBs可能作为关键中介。该成果为OBI人群的肝癌风险分层及靶向治疗提供了新机制依据。

　　肝炎B病毒（HBV）感染一直是全球公共卫生领域的重要挑战之一，其中肝细胞癌（HCC）是导致HBV相关死亡的主要原因之一。HBV感染不仅影响肝脏健康，还可能通过多种复杂的机制促进癌症的发生与发展。近年来，隐匿性HBV感染（OBI）作为一种特殊的HBV感染形式，逐渐受到关注。OBI的特点是血液中无法检测到HBsAg，但肝脏中仍可检测到具有复制能力的HBV DNA，或血液中存在低水平的病毒DNA（通常低于200 IU/mL）。尽管OBI在临床诊断中较为隐蔽，但已有研究表明其与慢性肝病进展及肝细胞癌的发生密切相关，尤其是在一些无法明确病因的肝癌病例中，约有70%被发现与OBI相关。因此，深入探讨OBI中HBV基因突变，特别是前S区域的点突变，如何影响细胞增殖及癌变过程，具有重要的科学意义和临床价值。

前S区域是HBV基因组中一个高度变异的区域，与S区域共同编码三种病毒表面蛋白：小表面蛋白（SHBs）、中表面蛋白（MHBs）和大表面蛋白（LHBs）。在HBV感染过程中，前S区域的突变，尤其是缺失型突变，已被证明能够通过激活多种致癌信号通路促进肝细胞增殖，从而增加HCC的风险。然而，对于其他类型的前S突变，尤其是点突变，其在肝癌发生中的具体作用和机制仍不明确。因此，本研究旨在系统评估这些高频率的OBI相关前S点突变对宿主细胞增殖的影响，并探讨其可能的致癌特性。

研究团队基于之前在约300名OBI献血者中发现的多个高频率前S点突变，构建了20种前S突变质粒，并通过细胞增殖实验评估这些突变对Huh-7细胞增殖能力的影响。实验结果表明，多个前S1区域（如E39K、D44N、V60A、F67L、T68I、S78N、L85F和N98T）以及前S2区域（如T126I、H128R和I161T）的突变显著增强了细胞增殖能力。这些突变主要位于HBsAg编码区域，因此进一步通过Western blot分析其对HBsAg表达的影响。结果显示，大多数促进增殖的突变能够直接提升细胞内LHBs的表达水平，而某些突变（如T68I、T126I和H128R）虽然不增加LHBs的绝对表达量，但显著提高了LHBs与SHBs的比例，从而实现了LHBs的相对过表达。

为了进一步探究这些突变如何促进细胞增殖，研究团队还分析了其对Akt/mTOR信号通路的影响。通过使用多种小分子抑制剂（如LY294002、Wortmannin、PD98059、U0126、Adezmapimod、PP2、MK2206和Rapamycin）进行处理，研究人员发现，五种特定的前S点突变（E39K、D44N、N98T、H128R和I161T）能够显著激活Akt/mTOR信号通路，并增强其下游效应因子S6K的磷酸化水平。这表明，这些突变可能通过激活Akt/mTOR通路，促进细胞增殖。此外，通过Western blot和实时定量PCR分析，研究团队还发现这些突变能够显著提升Cyclin D1的表达水平，同时增加Rb蛋白的磷酸化程度，从而推动细胞从G1期向S期的过渡。

进一步的机制研究揭示，Akt/mTOR信号通路的激活是这些突变促进细胞增殖的关键因素之一。通过使用Akt和mTOR抑制剂进行干预实验，研究人员发现，这些突变诱导的增殖优势在很大程度上依赖于Akt/mTOR/Cyclin D1信号轴。特别是mTOR抑制剂Rapamycin，因其主要针对mTORC1复合体，而非mTORC2复合体，因此可以有效验证这些突变对mTORC1活性的影响。实验结果表明，这些突变不仅激活了Akt/mTOR信号通路，还通过上调Cyclin D1表达和促进细胞周期调控，显著增强了细胞的增殖能力。

在细胞周期调控方面，研究团队发现这些突变能够显著减少G0/G1期细胞的比例，同时增加S期细胞的比例，从而促进细胞从G1期向S期的过渡。这一过程是细胞增殖的关键环节，因为S期是DNA复制发生的主要阶段，而G1期则是细胞决定是否进入分裂的关键时期。因此，这些突变通过改变细胞周期的调控机制，促进了细胞的异常增殖。此外，研究还发现，LHBs可能是这些突变激活Akt/mTOR/Cyclin D1信号轴的重要媒介。通过构建仅表达WT LHBs或N98T突变型LHBs的质粒，研究人员验证了LHBs过表达足以激活Akt/mTOR信号通路，提高Cyclin D1及其相关细胞周期调控因子的表达水平，并增强细胞增殖能力。尤其是N98T突变型LHBs，其效果更为显著。

LHBs作为HBV三种表面蛋白之一，在HBV感染中被认为是最具致癌潜力的蛋白。此前已有研究指出，LHBs的过表达与肝细胞癌的发生和发展密切相关，尤其是在前S缺失突变的背景下。因此，本研究的发现进一步支持了LHBs在HBV相关肝癌发生中的核心作用。此外，LHBs的表达水平不仅与肝癌的发生有关，还与患者的预后密切相关。研究显示，血清或肝脏中LHBs水平较高往往与疾病的晚期阶段和较差的临床结局相关，包括总体生存率和无进展生存率的下降。因此，监测HBV感染者中的LHBs表达水平，对于评估肝癌风险和预测疾病进展具有重要意义。

尽管本研究重点探讨了OBI相关前S点突变对细胞增殖和肝癌发生的影响，但仍存在一定的局限性。例如，研究主要集中在细胞增殖和信号通路激活，而未涉及HBV相关肝癌发展的其他方面，如肿瘤微环境、免疫逃逸机制或治疗反应等。此外，OBI相关的前S突变可能在不同地理区域或人群中表现出不同的流行特征和临床表现，因此未来的研究需要进一步探索这些突变在不同人群中的分布情况及其对疾病进展的具体影响。同时，随着对mTORC1和mTORC2功能差异的研究不断深入，未来可能需要更详细地分析这些突变如何分别影响这两个复合体的活性，从而更全面地理解其在肝癌发生中的作用机制。

本研究的结果为HBV相关肝癌的发病机制提供了新的视角，也为临床中识别高风险个体和开发新的治疗策略提供了理论依据。通过揭示这些前S点突变如何通过激活Akt/mTOR/Cyclin D1信号轴促进细胞增殖，研究人员不仅加深了对HBV感染与肝癌关系的理解，还为针对特定突变的靶向治疗提供了可能的方向。此外，研究团队还强调，未来需要整合基础研究和临床研究，进一步探讨前S突变在肝癌各个阶段中的作用及其分子机制，以期为临床诊断和治疗提供更全面的支持。

综上所述，本研究系统分析了OBI相关前S点突变对细胞增殖的影响，并揭示了其通过激活Akt/mTOR/Cyclin D1信号轴促进肝癌发生的作用机制。这些发现不仅有助于理解HBV感染如何导致肝癌，还可能为高风险人群的筛查和相关疾病的治疗策略提供新的思路。随着对HBV及其突变的深入研究，未来有望开发出更精准的诊断方法和更有效的治疗手段，以改善HBV相关肝癌患者的预后。