牙周韧带细胞的基质硬度诱导的机械记忆功能促进了牙周骨修复过程中的骨形成

《International Dental Journal》：Matrix Stiffness-Induced Mechanical Memory of Periodontal Ligament Cell Promotes Osteogenesis in Periodontal Bone Repair

基质刚度诱导的机械记忆通过调控hPDLCs的YAP/TAZ通路增强成骨分化，移植细胞片在rat骨缺损模型中显著促进骨再生。

　　本研究围绕人类牙周韧带细胞（hPDLCs）的机械记忆效应展开，重点探讨了不同基质刚度对hPDLCs骨生成潜能的影响及其在牙周骨缺损修复中的应用潜力。通过构建不同刚度的GelMA水凝胶模型，研究人员成功地模拟了体内机械环境的变化，并利用细胞片移植技术验证了机械记忆在体内的持续作用。研究结果表明，由刚性基质诱导的机械记忆显著增强了hPDLCs的骨生成能力，为牙周骨修复提供了新的策略。

在实验设计中，研究团队首先制备了不同浓度的GelMA水凝胶，分别对应软基质（12 kPa）和硬基质（159 kPa）。通过调整水凝胶的浓度，研究人员能够控制其刚度，从而为hPDLCs提供不同的机械环境。随后，他们对hPDLCs在这些基质上的生物相容性进行了评估，使用活/死染色和CCK8试剂盒检测细胞的存活率和增殖能力。结果显示，hPDLCs在软基质和硬基质上的存活率均较高，且硬基质组的细胞增殖能力显著优于软基质组。这一发现表明，不同刚度的水凝胶能够有效支持hPDLCs的生长，并且刚度的增加对细胞增殖具有积极影响。

为了进一步评估hPDLCs的骨生成潜能，研究团队进行了碱性磷酸酶（ALP）染色和实时荧光定量PCR（qPCR）实验。ALP染色是骨生成早期的一个重要标志物，能够反映细胞开始矿化和骨形成的能力。结果显示，在硬基质培养的hPDLCs中，ALP活性显著增强，且在第7天和第14天的染色强度和面积均高于软基质组。qPCR实验则用于检测与骨生成相关的基因表达水平，包括ALP、胶原蛋白I（COL-1）、骨磷蛋白（OPN）和Runx2等。研究发现，这些基因在硬基质组中的表达水平明显高于软基质组，尤其是在第4天和第7天时，Runx2的表达量显著上升，表明硬基质环境更有利于hPDLCs向成骨细胞分化。

此外，研究团队还通过细胞片移植技术将预先在不同刚度基质上培养的hPDLCs植入到大鼠的牙槽骨缺损模型中。该模型通过手术在下颌前牙的颊侧创建了标准化的骨缺损（5 × 2 × 1 mm3）。在术后2、4和6周的时间点，研究人员利用微CT、HE染色和Masson染色对骨修复情况进行评估。微CT图像显示，硬基质组的骨修复效果优于软基质组和对照组。HE染色结果也表明，硬基质组在骨缺损区域形成了更多的纤维组织和骨组织，而对照组主要表现为纤维组织，缺乏明显的骨形成。Masson染色进一步证实了这一现象，显示硬基质组的胶原纤维沉积更加丰富，且在术后6周时，骨组织的形成量达到最高水平。

这些实验结果表明，由刚性基质诱导的机械记忆不仅在体外显著促进了hPDLCs的骨生成潜能，而且在体内也表现出持续的促进作用。即使在机械刺激被移除后，hPDLCs仍然能够维持其骨生成能力，这为牙周骨缺损的修复提供了新的思路。研究还指出，机械记忆的形成可能与细胞内部的信号传导通路有关，例如YAP/TAZ通路和Wnt/β-catenin通路，这些通路在细胞响应机械刺激和维持其分化状态方面起着关键作用。

在讨论部分，研究团队强调了机械记忆在组织工程中的重要性。机械记忆是指细胞能够记住其之前所处的机械环境，并在后续的微环境中持续响应这种记忆。这一现象在干细胞研究中已有报道，例如间充质干细胞（MSCs）在从硬基质转移到软基质后，仍能保持一定的成骨标志物表达水平。因此，机械记忆可能成为一种重要的调控手段，用于引导细胞分化和组织再生。研究还指出，hPDLCs在牙周组织修复中具有独特的优势，其不仅易于获取，而且具备良好的增殖能力和多向分化潜能，这使其成为一种理想的治疗细胞来源。

进一步的研究表明，机械记忆与生化信号之间的协同作用可能对牙周骨再生具有更大的促进效果。例如，低浓度的氯化镁（MgCl?）已被证明能够增强hPDLCs的增殖能力，提高ALP活性，并促进矿化结节的形成。这表明，机械记忆与生化刺激的结合可能是一种优化牙周骨修复的新策略。同时，研究团队也提到，细胞片技术在组织再生中的应用具有广阔的前景。与传统的支架材料或水凝胶封装方法相比，细胞片技术能够保留细胞的天然细胞外基质（ECM）成分，如胶原蛋白和纤维连接蛋白，同时维持较高的细胞密度。这种结构优势不仅有助于细胞与基质之间的持续相互作用，还能通过细胞间的信号传导（如Notch信号）增强机械记忆效应，并改善局部血管微环境，从而促进骨再生。

此外，研究团队还指出，细胞片技术在修复复杂骨缺损方面具有独特的优势。由于细胞片可以折叠并贴合缺损区域的形状，因此能够提高治疗的精确性和有效性。在本研究中，应用hPDLC细胞片的策略不仅保留了细胞的机械记忆，还为牙周骨再生提供了一个稳定的平台。这一方法在临床应用中具有较高的可行性，因为它避免了传统细胞培养方法中可能产生的细胞功能受损问题，同时保持了细胞的活性和分化能力。

总体来看，本研究通过系统地分析机械记忆对hPDLCs骨生成潜能的影响，揭示了基质刚度在调控细胞行为中的重要作用。研究结果不仅为牙周骨缺损的修复提供了新的生物材料和细胞工程策略，还为未来临床应用中的材料设计和细胞培养条件优化提供了理论依据。此外，研究还强调了机械记忆与生化信号协同作用的潜力，以及细胞片技术在组织工程中的应用前景。这些发现对于开发更加安全、高效、可预测的牙周组织再生方法具有重要意义。未来的研究需要进一步探索机械记忆的分子机制，验证其在大型动物模型中的效果，并评估其在临床应用中的长期安全性和有效性。同时，研究团队还建议开发能够模拟自然骨修复过程中基质刚度逐渐变化的动态材料，以更贴近体内环境，提高修复效果。这一研究为牙周骨再生领域带来了新的希望，也为其他组织工程研究提供了参考价值。