复合杂合子 NFKB1错义变异 顺式关联的免疫缺陷

《Clinical Immunology》：Compound heterozygous NFKB1 missense variants in cis associated with immunodeficiency

NFKB1复合杂合突变Q50H和K52N导致p50蛋白功能异常，引发免疫缺陷。研究表明单一突变在体外实验中表现中性，但联合存在时通过蛋白相互作用改变和DNA结合缺陷产生致病效应，强调基因分析需考虑cis复合变体。

　　这项研究聚焦于一种遗传性免疫缺陷疾病，其背后是**NFKB1基因**中两个错义突变的共同作用。NFKB1基因编码了NF-κB信号通路中的核心蛋白p105，而该蛋白经过蛋白酶体的加工后会转化为成熟的核心转录因子p50。p50在免疫系统中扮演着至关重要的角色，它参与调控多种免疫相关基因的表达，包括那些与炎症反应、细胞存活和免疫应答相关的基因。因此，NFKB1基因的突变可能导致免疫功能障碍、自身炎症或自身免疫等疾病表现。然而，对于某些突变，尤其是错义突变，其致病性可能并不明显，需要通过深入的功能性分析才能确认。

在这项研究中，研究人员发现了一名60岁女性患者，其携带了**NFKB1基因**中两个位于同一条染色体上的错义突变，分别为c.[150A?>?C;156A?>?C]，对应于p50蛋白中的Q50H和K52N两种氨基酸替换。尽管这两个突变单独分析时似乎并未对p50的表达或稳定性造成显著影响，但它们在**同源异构**（即在同一个等位基因上）的情况下，共同作用导致了明显的蛋白缺陷。这一发现揭示了在遗传分析中，仅考虑单个突变可能无法准确评估其致病性，尤其是在存在复合杂合情况时。

### 疾病表现与临床背景

该患者自27岁起便表现出反复的鼻窦炎和肺部感染，35岁时检测到低免疫球蛋白血症（hypogammaglobulinemia），46岁时出现由**Giardia lamblia**引起的肠炎，47岁时确诊为肛门癌并接受放疗和化疗治疗。52岁时被诊断为间质性肺病，肺部扩散能力有所下降。58岁时，她感染了**SARS-CoV-2**病毒，需要长期的抗生素治疗。此外，她的免疫系统表现出明显的缺陷，包括B细胞数量显著减少，而T细胞的某些亚群（如记忆性T细胞）也出现异常。值得注意的是，尽管她的免疫球蛋白水平有所改善，但反复的感染依然存在，这提示其免疫功能仍然存在严重缺陷。

在免疫表型分析中，患者的B细胞计数极低，且表现出特定的表型特征，例如过渡性B细胞和CD21低表达B细胞的增加，以及记忆性B细胞的完全缺失。同时，CD4+ T细胞数量也显著减少，而CD8+ T细胞和自然杀伤（NK）细胞的水平则相对正常。这些异常的免疫表型特征强烈提示了免疫缺陷的存在，并支持了NFKB1基因突变在疾病发生中的作用。

### 突变的遗传背景与功能分析

患者携带的两个NFKB1错义突变位于p105蛋白的Rel同源结构域（RHD）的N端，这一区域对于p50的DNA结合能力、二聚化以及与IκB蛋白的相互作用至关重要。研究人员通过基因组DNA的提取和测序技术，确认了这两个突变的存在，并发现它们出现在同一等位基因上（即**cis**复合杂合状态）。为了进一步评估这两个突变的功能性影响，研究人员采用了一种**体外功能测试**方法，通过在HEK293T细胞中瞬时过表达EGFP标记的突变p50蛋白，观察其在细胞内的定位、表达水平和DNA结合能力。

实验结果显示，单独的Q50H突变在细胞内能够均匀分布于细胞核，并且其表达水平和稳定性与野生型p50相似，表明该突变可能对p50的功能影响较小。相比之下，K52N突变虽然在单独分析时表现出一定的DNA结合能力减弱，但其影响仍然有限。然而，当这两个突变同时存在于同一个等位基因上时，它们的共同作用导致了显著的蛋白缺陷。具体表现为：突变p50在细胞核中形成密集的斑点状聚集结构，其表达水平明显降低，并且其DNA结合能力也显著减弱。这种功能异常与某些已知的导致p50蛋白功能丧失的突变（如Y350C）类似，但其影响程度较轻。

### 研究方法与技术手段

为了验证这些突变的功能性影响，研究人员采用了一系列实验技术。首先，他们使用了**靶向下一代测序（Targeted Next Generation Sequencing, NGS）**，对患者的基因组进行了分析，并结合**Sanger测序**对候选突变进行了确认。此外，他们还通过**克隆分析**，确认了这两个突变确实位于同一个等位基因上，而非分属不同等位基因（即**trans**状态）。由于患者的B细胞数量过低，无法进行更深入的免疫细胞功能研究，因此他们转而研究CD4 T细胞中的p105/p50表达情况，发现其表达水平仅轻微下降，不足以支持其为NFKB1相关免疫缺陷的直接诊断。

为了解释这一现象，研究人员采用了**体外过表达系统**，将突变的p50蛋白与荧光蛋白（如EGFP）融合，以更清晰地观察其在细胞内的分布和功能。在这些实验中，研究人员发现，单独的Q50H突变在细胞核中均匀分布，而K52N突变虽然表现出一定的DNA结合能力下降，但其影响仍较为温和。然而，当两者共同存在时，突变p50的表达水平显著降低，并且在细胞核中形成异常的聚集结构，这表明它们共同作用可能对NF-κB信号通路造成了实质性的影响。

### 突变的相互作用与疾病机制

进一步的实验分析表明，这两个突变的组合对p50蛋白的DNA结合能力产生了协同效应。例如，在**电泳迁移率变动分析（EMSA）**中，研究人员发现，单独的K52N突变导致DNA结合能力下降约39%，而Q50H突变则对DNA结合能力影响较小。然而，当两者共同存在时，DNA结合能力下降至约65%。这种协同效应表明，某些突变虽然单独分析时可能表现为“中性”或“轻微异常”，但它们在遗传背景中可能具有更强的致病潜力。

此外，研究人员还利用**荧光报告基因系统**（如tdTomato）来评估突变p50对NF-κB信号通路的调控能力。结果显示，Q50H突变本身对RelA介导的激活作用没有明显影响，而K52N突变则表现出一定程度的抑制作用。当两者共同存在时，这种抑制作用被显著增强，表明它们的协同作用可能对免疫系统的正常功能造成了更严重的影响。

### 研究的意义与启示

这项研究揭示了在遗传性免疫缺陷疾病的诊断中，仅依赖于单个突变的分析可能遗漏重要的致病信息。尤其是在处理**复合杂合**（cis）突变时，单独分析每个突变可能无法准确评估其对蛋白质功能的影响。这提示我们在遗传分析过程中，需要更加关注突变之间的相互作用，尤其是在某些罕见突变可能被误判为“中性”或“无意义”时，它们的协同作用可能对疾病的发生起到关键作用。

此外，这项研究也强调了**功能性分析**在遗传病诊断中的重要性。尽管NGS技术能够快速识别基因突变，但其对突变致病性的判断仍需依赖于实验验证。特别是对于那些在常规分析中表现“中性”的突变，可能需要通过更精细的实验手段（如体外过表达、蛋白互作分析、DNA结合能力测试等）来进一步评估其潜在的致病性。

### 未来的研究方向

研究人员指出，未来的遗传学研究需要更加全面地分析患者基因组中的突变情况，尤其是那些可能被忽略的**复合杂合**或**异源杂合**（trans）突变。这不仅有助于更准确地诊断遗传性免疫缺陷疾病，还可能揭示新的致病机制，为临床治疗提供更有力的依据。同时，随着对**NF-κB通路**相关基因突变的进一步研究，可能会发现更多类似的情况，即某些突变单独作用时表现不明显，但在特定遗传背景下才会表现出显著的致病性。

此外，这项研究还强调了**基因-环境交互作用**的重要性。虽然目前的实验手段无法直接评估环境因素对疾病的影响，但结合已知的遗传风险因素（如TACI基因中的A181E突变），可能有助于更全面地理解疾病的复杂性。例如，TACI基因中的A181E突变虽然在常规分析中可能被认为是“中性”或“无害”，但在某些情况下可能与NFKB1的突变协同作用，导致更严重的免疫缺陷。

### 对临床诊断的启示

这项研究对临床实践具有重要的指导意义。首先，它提醒我们，在进行遗传分析时，不能仅依赖于突变的频率或已知致病性来判断其是否与疾病相关。某些罕见突变可能在特定的遗传背景下表现出显著的致病性，因此需要更细致的分析方法。其次，它强调了**功能性实验**在突变致病性评估中的必要性，尤其是在无法从患者样本中获得足够的细胞材料时，体外实验仍然是重要的诊断工具。

最后，这项研究也提出了一个重要的挑战：如何在大规模的遗传筛查中识别出那些可能被忽略的复合突变。随着基因组测序技术的普及，越来越多的患者被发现携带多种突变，但其中许多突变的致病性尚未明确。因此，未来的遗传研究需要更加关注突变之间的相互作用，以及它们在不同细胞类型中的表达和功能表现。这将有助于更精准地识别遗传性免疫缺陷疾病的病因，并为患者提供更个性化的治疗方案。