抑制USP10可以缓解小鼠持续的角膜上皮缺陷

《The American Journal of Pathology》：Silencing USP10 alleviates persistent corneal epithelial defect in mice

本研究利用自递送siRNA（sdRNA）靶向去泛素化酶USP10，在小鼠和兔子的持续性角膜上皮缺陷（PCED）模型中验证了其治疗效果。单次sdRNA注射显著防止了角膜伤口在28天后的重新开放，并通过改善角膜结构、减少疤痕形成和炎症细胞浸润，证明了USP10在调控角膜再生中的关键作用。RNA测序显示USP10敲低促进了细胞增殖相关通路，同时抑制了纤维化相关基因表达，如α-SMA、FN1和Col3a1。该疗法为PCED等难治性角膜疾病提供了新策略，并可能扩展至其他组织修复领域。

　　持续性角膜上皮缺损（PCED）是一种严重的疾病，通常发生在角膜受伤后，上皮层未能正常愈合，从而导致视力受损。PCED不仅影响角膜的表面结构，还可能进一步影响角膜的基质层，引发炎症反应和瘢痕形成，进而影响视力。这种疾病可以由多种原因引起，包括化学烧伤、角膜糜烂、角膜缘干细胞缺乏、史蒂文斯-约翰逊综合征、血管炎、溃疡性角膜炎、病毒感染、干眼症和神经性角膜炎等。这些疾病通常具有慢性特征，且在某些情况下会导致角膜瘢痕形成。由于目前尚无针对所有PCED病因的FDA批准的治疗方案，因此探索新的治疗策略对于改善患者的预后具有重要意义。

USP10是一种去泛素化酶（DUB），在组织修复和瘢痕形成过程中起着关键作用。此前的研究表明，USP10在角膜损伤后表达上调，并且在原代人角膜成纤维细胞中，它通过后翻译修饰调控αv整合素。USP10通过移除β整合素亚基的胞内结构域中的泛素，促进整合素和基质的再循环，而不是降解，从而导致整合素在细胞表面的积累。这种细胞表面整合素的异常积累可能激活过度的粘附、收缩以及纤维化TGFβ的自分泌循环。而USP10的敲低则会增加整合素的泛素化并促进其正常降解，从而抑制整合素在细胞表面的积累。

本研究利用了一种高度修饰的体内自递送siRNA（sdRNA）靶向USP10，并在PCED小鼠模型中测试其对角膜上皮再开裂的预防效果。该模型中，角膜上皮在损伤后初期闭合，但在第28天时再次开裂，从而模拟了PCED的病理过程。研究发现，USP10靶向sdRNA在损伤后单次施用即可有效防止角膜上皮在第28天的再开裂，同时减少瘢痕形成和炎症反应，维持角膜结构和完整性。此外，USP10的敲低改变了角膜上皮再生过程中基因表达和调控组织修复的通路，具体表现为细胞增殖通路增强，而导致瘢痕形成的细胞外基质（ECM）、整合素和免疫细胞特征则被抑制。

在实验设计中，研究团队首先进行了体外的剂量曲线实验，以评估USP16和USP16.1这两种靶向USP10的sdRNA在细胞内的作用效果。体外实验显示，尽管在最高浓度（2μM）下，USP16和USP16.1之间存在一定的差异，但在体内实验中并未观察到这种差异，表明体内使用浓度（20μM）可能已经达到了饱和或其作用效果更为显著。此外，研究团队还对兔子进行了角膜划痕实验，评估了USP10靶向sdRNA的安全性和有效性。实验结果表明，sdRNA在体内具有良好的穿透性和稳定性，能够有效减少瘢痕形成和炎症反应。

在实验方法方面，研究团队采用了多种技术手段来评估sdRNA对角膜结构和功能的影响。其中包括荧光素染色以检测角膜上皮的再开裂情况，光学相干断层扫描（OCT）用于观察角膜形态变化，免疫组化（IHC）用于检测角膜上皮结构恢复情况，以及RNA测序用于分析基因表达变化。通过这些方法，研究团队发现USP10靶向sdRNA能够显著改善角膜结构，恢复上皮层的分层，促进基底膜的再形成，并减少瘢痕和炎症细胞的浸润。

在实验结果中，研究团队发现，接受USP10靶向sdRNA治疗的小鼠角膜在第28天时，其上皮层未出现再开裂现象，而对照组（PBS和NTC）则表现出明显的再开裂。同时，OCT图像显示，治疗组的角膜形态更加规则，瘢痕形成减少。IHC分析进一步证实，治疗组的角膜基底膜恢复良好，且基底膜连接蛋白（如Collagen XVII）的表达显著增加。此外，RNA测序结果显示，USP10的敲低显著改变了角膜上皮再生过程中的基因表达模式，包括上调细胞周期调控、微管动态和DNA修复相关基因，同时下调与细胞迁移、细胞外基质（ECM）相互作用和趋化作用相关的基因，这表明USP10靶向sdRNA能够有效促进角膜上皮的再生，并减少瘢痕形成。

研究团队还评估了sdRNA对角膜内皮的影响，发现其对内皮细胞的形态和密度没有显著影响，表明该治疗策略在维持角膜结构完整性方面具有良好的安全性。此外，通过分析CD45+细胞的数量，研究团队发现治疗组的炎症细胞浸润显著减少，进一步支持了USP10靶向sdRNA在减少炎症反应方面的有效性。

在分子机制方面，研究团队通过RNA测序和GO富集分析，揭示了USP10靶向sdRNA对角膜上皮再生的调控作用。USP10的敲低不仅促进了细胞增殖，还抑制了与瘢痕形成相关的细胞外基质沉积。同时，通过分析反应途径，研究团队发现USP10的调控作用涉及多个层面，包括细胞周期调控、微管动态、DNA修复以及炎症反应的调控。这些发现表明，USP10在角膜修复过程中起着关键作用，而靶向其表达的sdRNA可能成为一种有效的治疗策略。

综上所述，本研究通过体内自递送siRNA（sdRNA）靶向USP10，成功预防了PCED模型中角膜上皮的再开裂，并显著减少了瘢痕和炎症反应。这些结果不仅为PCED提供了一种新的治疗策略，还为其他组织的再生性愈合提供了潜在的应用价值。未来的研究将进一步探索USP10在不同组织中的作用机制，以及其在治疗其他类型组织损伤中的潜力。