生长条件对Pheronema carpenteri可培养细菌丰度、多样性及其抗菌潜力的影响研究

《FEMS Microbes》：Impact of growth conditions on the abundance and diversity of cultivable bacteria recovered from Pheronema carpenteri and investigation of their antimicrobial potential

本研究针对新型抗生素发现瓶颈，通过优化培养策略从深海玻璃海绵Pheronema carpenteri中挖掘微生物资源。研究人员采用稀释至灭绝(D:E)和放线菌定向培养(ADC)技术，结合OSMAC（一株多化合物）方法，从389株细菌中筛选出72株（18.6%）对ESKAPE病原体（包括MRSA和VRE）具有抗菌活性的菌株。研究证实培养条件显著影响物种多样性，且早期OSMAC策略可将活性菌株发现率提升16.7%，为深海微生物资源开发提供新范式。

　　

随着抗生素耐药性危机日益严峻，人类迫切需要从非传统环境中发现新型抗菌化合物。深海因其极端环境（低温、高压、低营养）孕育着独特的微生物群落，成为新型天然产物挖掘的宝库。其中，深海海绵作为"微生物酒店"，其共生的细菌群体展现出丰富的生物活性潜力。然而，传统培养方法仅能捕获不到1%的微生物多样性，导致大量具有生物活性的菌株被遗漏。

在这项发表于《FEMS Microbes》的研究中，研究人员将目光投向了东北大西洋深海的玻璃海绵Pheronema carpenteri。这种海绵以往研究较少，但其脆弱的骨骼结构暗示其共生微生物可能具有独特的防御机制。为了克服"平板计数异常"难题，研究团队设计了一套多维培养策略，系统评估了不同营养条件、温度和培养技术对可培养细菌多样性及其抗菌潜力的影响。

研究的关键技术方法包括：1）采用稀释至灭绝(D:E)和放线菌定向培养(ADC)两种策略，使用16种培养基配方；2）针对来自3个Pheronema carpenteri海绵样本（JC136_066、JC136_125、JC136_134）的389个细菌分离株进行抗菌活性筛选；3）应用早期OSMAC方法通过改变pH、碳氮源等条件激活沉默生物合成基因簇；4）通过16S rRNA基因测序进行菌株鉴定和系统发育分析。

Oligotrophic and Eutrophic Conditions Affect the Level of Growth Observed

研究发现营养浓度直接影响细菌生长水平。在28°C条件下，富营养培养基（如未稀释的MA、R2A、NA）在第五周即可达到80%以上的孔底覆盖率，而寡营养条件（如MB 1:2、NB 1:100）生长缓慢（0-70%）。延长孵育时间至八周后，寡营养条件下的生长显著改善，表明深海微生物需要更长的适应期。统计分析显示，28°C时富营养与寡营养条件对生长有显著影响（p<0.0001），而4°C时无显著差异。

Temperature Affects the Level of Observed Diversity on Solid Agar

温度对细菌多样性有显著影响。4°C条件下仅获得少量分离株，而20°C和28°C则分别获得95个和更多样化的菌落。培养基类型也影响物种组成：R2A和NA主要分离出芽孢杆菌属，而SCA和ISP2则更适合放线菌生长。添加3.3% Instant Ocean(IO)在多数情况下降低了多样性。

Bacteria Recovered from Dilution to Extinction and Actinobacteria Directed Cultivation Methods and their Bioactivity

从三个海绵样本中共获得273株D:E分离株和116株ADC分离株。活性菌株比例在不同海绵间差异显著（JC136_125：31%，JC136_066：12%，JC136_134：28%）。ADC方法获得的活性菌株比例较低（9%），但包含了更多放线菌资源。

Impact of Nutrient Conditions on Active Isolate Recovery

海洋肉汤(MA)及其1:2稀释液是获得活性菌株的最佳培养基（22和17个活性菌株），而营养肉汤(NA)虽获得最多分离株，但活性比例最低。在ADC条件下，ISP2培养基表现出最高的活性率（5/6）。

Bioactivity was observed towards Gram-negative and Gram positive pathogens in dilution to extinction conditions

72个活性菌株对ESKAPE病原体表现出不同抗菌谱。54.1%的菌株对金黄色葡萄球菌(S. aureus)有活性，其中35%可抑制两种以上病原体。一株菌株同时抑制耐万古霉素粪肠球菌(VRE)、粪肠球菌和铜绿假单胞菌。所有菌株均对鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌和白色念珠菌无活性。

Cultivation Techniques Directly Influence the Species Diversity

16S rRNA基因测序显示，D:E方法主要获得芽孢杆菌属（如Bacillus subtilis），而ADC方法则倾向于放线菌门（如链霉菌属）。两种方法均可交叉捕获部分菌株，证明培养策略直接影响物种多样性。

Isolates of the same species can exhibit varying levels of activity

研究发现相同物种（如Bacillus subtilis）的不同菌株表现出显著不同的抗菌谱。例如，菌株152和316均与Bacillus subtilis KBL27高度同源，但前者抑制三种病原体，后者仅抑制一种。这表明16S rRNA基因序列相同菌株的次级代谢能力可能存在显著差异。

An OSMAC Approach Triggers Antimicrobial Production

通过改变pH和营养条件，OSMAC方法成功激活了12个最初无活性的菌株。pH 5和pH 9条件下分别触发7和8个活性事件，其中MA和NA在碱性条件下效果最佳。碳氮源调整也成功诱导了5个菌株的抗菌活性，证明环境应激可有效激活沉默生物合成基因簇(BGCs)。

本研究证实，培养条件的选择直接影响从Pheronema carpenteri中获得的微生物多样性及其生物活性潜力。采用多维培养策略（包括D:E、ADC和早期OSMAC）可显著提高活性菌株的发现率，避免因形态选择偏见而遗漏有价值菌株。深海玻璃海绵共生微生物，特别是芽孢杆菌和放线菌，展现出对ESKAPE病原体的显著抑制活性，且相同物种的不同菌株可能具有截然不同的代谢能力。这些发现不仅为抗生素发现提供了新思路，也强调了在微生物资源挖掘中采用综合培养策略的重要性。未来对深海海绵微生物群的持续探索，有望为解决抗生素耐药性危机贡献更多新型化合物。