IGFL2-AS1通过YBX1/HSPA1A/RAP1轴介导非小细胞肺癌化疗耐药与转移的机制研究

《Cellular & Molecular Biology Letters》：lncRNA IGFL2-AS1 mediates NSCLC chemoresistance via YBX1-induced HSPA1A/RAP1 activation

本研究针对非小细胞肺癌(NSCLC)化疗耐药和转移的临床难题，揭示了长链非编码RNA IGFL2-AS1通过转录因子YBX1调控HSPA1A/RAP1信号通路的新机制。研究人员发现IGFL2-AS1在化疗耐药细胞株和肺癌组织中异常高表达，通过体外功能实验和体内动物模型证实其促进肺癌增殖、转移、干细胞特性及多药耐药的关键作用。机制上，IGFL2-AS1作为分子支架招募YBX1至HSPA1A启动子区域激活转录，进而激活RAP1等下游致癌通路。值得注意的是，HSPA1A抑制剂VER155008可显著恢复化疗敏感性。该研究为克服肺癌化疗耐药提供了新的靶点和联合治疗策略。

　　

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，其中非小细胞肺癌(NSCLC)约占85%。尽管靶向治疗和免疫治疗取得了进展，但以顺铂(DDP)为基础的化疗仍然是许多患者的一线治疗方案。然而，化疗耐药性的产生常常导致治疗失败，成为临床实践中的主要挑战。癌症耐药性的发展涉及复杂的网络，包括转录因子(TFs)和非编码RNA的调控。长链非编码RNA(lncRNAs)作为长度超过200个核苷酸的非编码RNA，在多种生理和病理过程中发挥着重要作用。近年来研究发现，lncRNAs通过调节药物外排、DNA损伤修复、细胞凋亡和氧化应激等方式，影响化疗、放疗、靶向治疗和免疫治疗的效果。然而，在肺癌中关键lncRNAs的功能和机制研究仍不充分。

热休克蛋白(HSPs)在肺癌标本中异常表达，与癌症的发生、进展和复发密切相关。HSP70家族由HSPA基因编码，其在肿瘤发生中的作用存在争议。特别是HSPA1A在各种恶性疾病中经蛋白酶体抑制剂处理后会被激活，代表了耐药癌细胞的一个脆弱环节。因此，靶向HSPA1A及其下游信号伙伴可能成为促进肺癌治疗的潜在策略。

本研究旨在识别新的lncRNA，作为肺癌耐药和转移的潜在诊断标志物或治疗靶点。研究人员通过RNA测序技术筛选与肺癌化疗耐药相关的关键lncRNA，并深入探讨其分子机制。研究成果发表在《Cellular & Molecular Biology Letters》期刊，为理解肺癌耐药机制提供了新的视角。

为开展本研究，研究人员应用了多种关键技术方法：通过RNA测序(RNA sequencing)筛选差异表达基因；利用体外功能实验（包括细胞增殖、克隆形成、Transwell迁移、肿瘤球形成和药物敏感性试验）评估基因功能；建立小鼠皮下移植瘤和尾静脉注射肺转移模型进行体内功能验证；采用RNA pulldown、RNA免疫共沉淀(RIP)、染色质免疫共沉淀(ChIP)和点突变/截断突变技术解析分子机制；通过组织微阵列(tissue microarray)染色评估临床标本中相关分子的表达及其与预后的关系。

IGFL2-AS1在耐药肺癌细胞中上调并预测患者不良预后

研究人员通过RNA测序发现，在顺铂耐药细胞系中，IGFL2-AS1是显著上调的lncRNA之一。验证实验表明，IGFL2-AS1在DDP和5-FU耐药的A549细胞以及多种肺癌细胞系中均异常高表达。荧光原位杂交(FISH)和核质分离实验证实IGFL2-AS1主要定位于细胞核。临床样本分析显示，IGFL2-AS1在肺癌组织中显著上调，且高表达与患者总生存期缩短相关。

IGFL2-AS1调控肺癌细胞增殖、转移、干细胞特性和多药耐药

功能实验表明，过表达IGFL2-AS1可促进肺癌细胞增殖、迁移、干细胞特性及相关标志物（ABCG2、OCT4、NANOG）表达，并提高对DDP和5-FU的IC₅₀值。相反，敲低IGFL2-AS1则抑制这些恶性表型，增强化疗敏感性。

IGFL2-AS1调控肺癌体内肿瘤增殖和药物敏感性

动物实验显示，敲低IGFL2-AS1可抑制皮下移植瘤的生长，增强DDP或5-FU的疗效。通过尾静脉注射建立的肺转移模型证实，IGFL2-AS1促进肺癌细胞向肺和脑转移，而敲低则显著减少转移灶形成。

C/EBPβ正向调控肺癌中IGFL2-AS1的转录

生物信息学分析预测C/EBPβ是IGFL2-AS1的上游调控因子。实验验证显示C/EBPβ在耐药细胞中高表达，且过表达C/EBPβ可上调IGFL2-AS1。染色质免疫共沉淀(ChIP)证实C/EBPβ结合于IGFL2-AS1启动子区的多个位点。

IGFL2-AS1通过HSPA1A调控肺癌细胞迁移和耐药

RNA测序显示IGFL2-AS1过表达细胞中HSPA1A显著上调。验证实验证实IGFL2-AS1正调控HSPA1A表达。回补实验表明，敲低HSPA1A可逆转IGFL2-AS1过表达促迁移、促干细胞特性和耐药的作用，而过表达HSPA1A则可挽救IGFL2-AS1敲低引起的表型。

IGFL2-AS1通过促进YBX1结合并激活转录来刺激HSPA1A表达

RNA pulldown联合质谱分析鉴定出YBX1与IGFL2-AS1特异性结合。实验验证了YBX1与IGFL2-AS1的直接相互作用，并确定了结合位点。机制上，IGFL2-AS1作为支架促进YBX1结合至HSPA1A启动子特定区域（P-H3区），激活其转录。同时，YBX1也结合IGFL2-AS1自身启动子，形成正反馈环路。

HSPA1A正向调控致癌通路并负向调控抑癌信号

RNA测序显示，敲低HSPA1A抑制RAP1、AMPK、Hippo、Hedgehog等多个致癌通路，同时激活p53和凋亡信号。IGFL2-AS1通过HSPA1A上调RAP1蛋白水平及其下游靶点（PI3K、VAV3、AFDN、MAP2K6），进而促进肺癌进展。

HSPA1A的药理学抑制恢复化疗敏感性并减弱肺癌细胞体内转移

体内实验表明，HSPA1A抑制剂VER155008单用或联合低剂量DDP/5-FU，可显著抑制皮下瘤生长和肺转移，增强化疗疗效。

IGFL2-AS1/YBX1/HSPA1A在临床标本中的表达及其与肺癌预后的关系

组织微阵列分析显示，YBX1和HSPA1A在肺癌组织中显著高表达，且与患者不良预后相关。IGFL2-AS1、YBX1和HSPA1A表达呈正相关，三者联合标志物对预后有更好的预测价值。

本研究系统阐明了IGFL2-AS1/YBX1/HSPA1A/RAP1轴在NSCLC化疗耐药和转移中的关键作用。在耐药肺癌细胞中，C/EBPβ驱动的IGFL2-AS1通过促进YBX1与HSPA1A启动子结合，激活其转录。YBX1同时促进IGFL2-AS1转录，形成正反馈环路。HSPA1A进而激活RAP1等多条下游致癌信号通路，导致肺癌耐药和转移。

该研究的创新点在于发现了一个全新的lncRNA介导的耐药机制，不同于已知的HOTAIR、MALAT1等lncRNAs的作用方式。IGFL2-AS1主要定位于核内，通过"分子引导"方式发挥作用。研究还证实靶向该通路的关键节点HSPA1A可有效逆转耐药，具有重要的临床转化价值。

然而，本研究主要基于细胞系和小鼠移植瘤模型，未来需要利用转基因小鼠模型或类器官-免疫细胞共培养系统，在更接近人体肿瘤微环境的条件下验证这些发现。此外，该通路在放疗、靶向治疗和免疫治疗中的作用也值得进一步探索。

总之，IGFL2-AS1/YBX1/HSPA1A轴的发现为理解NSCLC耐药机制提供了新视角，为该类患者的诊断和治疗提供了新的潜在靶点。针对这一通路的治疗策略可能为克服肺癌化疗耐药带来新的希望。