大麻基因型非依赖性再生新突破：基于子叶节直接器官发生的高效去 novo 再生体系

《Plant Methods》：Genotype-independent de novo regeneration protocol in Cannabis sativa L. through direct organogenesis from cotyledonary nodes

本研究针对大麻(Cannabis sativa L.)组织培养中存在的基因型依赖性和再生效率低等难题，开发了一种基于子叶节(CN)外植体的五阶段(S0-S4)高效直接器官发生再生方案。通过优化1%(v/v) H2O2灭菌方法显著提高种子萌发率并减少内生菌污染，在含TDZ和NAA的SRM培养基上14天即可诱导~70-90%的去novo再生效率，组织学分析证实再生芽源于皮层细胞而非愈伤组织。该方案在6个工业大麻品种和3个药用大麻品系中均表现稳定，平均每个响应外植体产生7个芽苗(~11.4芽/种子)，为大麻基因工程和规模化繁殖提供了关键技术支撑。

　　

在植物生物技术领域，高效的组织培养再生体系是基因编辑和转基因技术成功应用的关键前提。然而对于大麻(Cannabis sativa L.)这类具有重要药用价值的经济作物，其再生过程存在显著的基因型依赖性，导致现有技术难以在不同品种中稳定应用。尽管已有研究尝试通过子叶、下胚轴等外植体建立再生体系，但效率普遍较低(0-7.09%)且重复性差，严重限制了大麻品种改良和商业化开发的进程。

为突破这一技术瓶颈，澳大利亚拉筹伯大学的研究团队在《Plant Methods》发表了创新性研究成果。研究人员通过系统优化再生流程的五个关键阶段，成功开发出基于子叶节(cotyledonary node, CN)外植体的高效直接器官发生体系。该方案最大的突破在于实现了真正意义上的基因型非依赖性再生，在工业大麻和药用大麻多个品系中均获得稳定高效的再生效果。

关键技术方法

研究采用五阶段优化策略：S₀阶段使用1%(v/v) H₂O₂灭菌处理显著提高种子萌发率；S₁阶段比较不同胚胎外植体后确定CN为最佳材料，在含TDZ(0.4 mg/L)和NAA(0.2 mg/L)的SRM培养基上诱导去novo再生；S₂阶段通过定期继代培养在含IAA(0.175 mg/L)的SPM培养基上实现芽苗增殖；S₃阶段使用IAA或IBA促进伸长生根；S₄阶段完成驯化移栽。实验材料包括11个工业大麻品种和3个药用大麻品系，均来自商业供应商或合作企业。

S₀-灭菌与萌发优化

研究人员发现传统乙醇和次氯酸钠灭菌方法对田间种植的大麻种子效果不佳，萌发率仅约20%且内生菌污染严重。优化后的1%(v/v) H₂O₂双重处理(2×24 h)结合手工去除种皮和1 h振荡灭菌，使工业大麻品种Han FNH和Han FNQ的萌发率分别提升至78.2%和63.3%，且完全消除了表面微生物污染。新鲜种子表现更佳，萌发率达99.9%，内生菌污染率降至2.7%，证实种子新鲜度对再生体系建立至关重要。

S₁-外植体筛选与再生诱导

比较研究发现，传统子叶和下胚轴外植体在SRM培养基上几乎无法再生(0.1-2%)，而CN外植体在11个工业大麻品种中均成功诱导芽再生。进一步优化发现14天SRM暴露时间最为关键，相比对照培养基仅产生24.3%的腋芽伸长，SRM处理使总体再生效率提升至77.8%，其中去novo再生贡献70.1%。组织学分析明确区分两种再生途径：腋芽来自预存分生组织，而去novo芽起源于皮层细胞，无血管连接且不经过愈伤阶段。

S₂-芽苗增殖与S₃-生根驯化

定期继代培养是实现规模化繁殖的关键。SRM诱导的芽团在含IAA的SPM培养基上经三次继代后，平均每个响应外植体产生7个芽苗(Han FNH)，最高单种子产量达50个芽苗，显著优于对照处理的1.4个芽苗。生根阶段发现基因型特异性反应：工业大麻在IAA培养基上生根率较低(18.1-34.7%)且出现体外开花现象，而药用大麻在含IBA(0.5 mg/L)的培养基上生根率达66.7-81%。驯化移栽成功率100%，再生植株完成完整生活史并产生可育种子。

跨物种应用验证

该技术在8种药用植物中的验证显示，5种植物(Artemisia absinthium、A. vulgaris、Borago officinalis、Aloe ferox和Delonix regia)成功诱导去novo再生，其中4种地上型发芽植物与大麻类似，再生均起源于CN区域，表明该策略在双子叶植物中具有普适性。

研究结论与意义

这项研究通过精确解析大麻再生过程的细胞学基础，首次明确CN区域具有双重再生能力：既可激活预存腋芽，又能诱导皮层细胞去novo器官发生。优化的14天TDZ+NAA处理窗口有效平衡了再生效率与愈伤抑制，而定期继代策略实现了规模化繁殖。该方案在工业大麻和药用大麻中均保持~70-90%的高效再生，平均产量达7芽/外植体，较现有技术提升2-5倍，成功解决了基因型依赖性这一核心难题。

更重要的是，研究揭示的去novo再生细胞起源(皮层细胞)为遗传转化提供了理想靶点，其易于接触的特性有望显著提高转化效率并减少嵌合体产生。技术跨物种验证的成功，表明CN Explant策略特别适用于地上型发芽的药用植物，为其他顽固性物种的再生体系建立提供了范式。这项突破性工作不仅推动了大麻生物技术发展，也为药用植物遗传改良和可持续开发奠定了关键技术基础。