基于挂锁探针的荧光定量PCR方法的建立，用于检测SARS-CoV-2奥密克戎病毒中的S371L突变

《Journal of Fluorescence》：Establishment of a Padlock Probe-Based Fluorescence Quantitative PCR Method for the Detection of the SARS-CoV-2 Omicron S371L Mutation

本研究开发了一种结合锁探针技术与荧光定量PCR的新方法，用于快速特异性检测新冠病毒奥密克戎S371L突变。通过优化探针浓度、连接温度和时间等条件，实现了5.78 fM的检测灵敏度，特异性区分单、双、三碱基错配，回收率89.7%-108.0%。临床验证30例样本，与Sanger测序结果完全一致（预测值100%）。该方法无需反转录步骤，简化工作流程，适用于大规模筛查新兴变种。

　　

摘要

本研究旨在建立并验证一种新的检测方法，该方法结合了锁形探针技术与荧光定量PCR（qPCR），用于快速且特异性地检测SARS-CoV-2奥密克戎株刺突蛋白中的S371L突变。根据奥密克戎S371L突变位点设计并合成了锁形探针和扩增引物。该探针被设计为能够高特异性地与突变位点结合，仅在目标序列存在的情况下通过连接酶实现环化。环化的探针随后作为qPCR扩增的模板。实验优化包括探针浓度、连接温度、连接酶浓度和连接时间等参数。系统评估了该方法的分析灵敏度、特异性和回收性能。最后，使用30个临床样本对该方法进行了验证，并将结果与Sanger测序结果进行了比较。最佳实验条件确定为：锁形探针浓度为10 nM，连接酶浓度为0.2 U/μL，连接反应在65°C下进行30分钟，随后使用10 μL的环化产物进行qPCR扩增。在这些参数下，该方法达到了5.78 fM的检测限，并表现出良好的线性（R2 = 0.9669）。特异性测试显示，该探针能够清晰地区分突变模板与单碱基、双碱基或三碱基错配。性能评估显示，在PBS和尿液样本中，回收率范围为89.7%至108.0%。在临床验证中，该方法与Sanger测序结果完全一致，阳性预测值和阴性预测值均为100%。总之，本研究开发的基于锁形探针的qPCR检测方法为快速可靠地检测SARS-CoV-2中的奥密克戎S371L突变提供了一种有效途径。由于该方法无需经过通常针对RNA靶标所需的逆转录步骤，因此简化了实验流程，同时保持了检测准确性。这些特点表明，该方法非常适合广泛应用于临床检测，尤其是在大规模筛查新出现的SARS-CoV-2变种时。