铂纳米颗粒联合替莫唑胺增强U87胶质母细胞瘤细胞对兆伏X射线放射敏感性的协同机制研究

《Cancer Nanotechnology》：Platinum nanoparticles combined with temozolomide enhance radiosensitivity of U87 glioblastoma cells under megavoltage X-Ray irradiation

本研究针对胶质母细胞瘤(GBM)对传统放化疗耐药性强、血脑屏障(BBB)限制药物递送等临床难题，创新性地将铂纳米颗粒(Pt-NPs)与替莫唑胺(TMZ)联合应用于兆伏(MV)X射线放射治疗。研究人员通过系统评估发现，三联合方案(Pt-NPs+TMZ+2 Gy IR)可显著降低克隆存活率(SF=0.03)，诱导最高水平的DNA双链断裂(γ-H2AX阳性细胞达77.6%)和细胞凋亡(32.1%)，并引发显著的S期阻滞(60.7%)。该研究为克服GBM治疗抵抗提供了具有协同效应的纳米治疗新策略。

　　

胶质母细胞瘤(GBM)是成人中最具侵袭性的原发性脑肿瘤，患者生存期通常仅为数月到一年。当前标准治疗方案包括手术、放疗(RT)和辅助替莫唑胺(TMZ)化疗，但疗效常因肿瘤缺氧、放疗抵抗性癌症干细胞的存在以及血脑屏障(BBB)限制药物递送而大打折扣。尤其TMZ虽能透过血脑屏障，但其短暂的血浆半衰期和剂量依赖性毒性限制了治疗潜力。因此，开发能够增强放疗效果并克服耐药性的创新策略迫在眉睫。

纳米技术为这一难题带来了曙光。高原子序数(high-Z)金属纳米颗粒，如铂纳米颗粒(Pt-NPs)，因其独特的物理化学特性被视为极具潜力的放射增敏剂。当暴露于辐射时，Pt-NPs可通过产生二次X射线、光电子和俄歇电子局部增加辐射剂量，并催化活性氧(ROS)生成，从而导致DNA损伤。然而，Pt-NPs与TMZ在临床相关的兆伏(MV)X射线照射下的联合效应尚未得到系统研究。

在这项发表于《Cancer Nanotechnology》的研究中，Soonthornchookiat等人首次系统评估了Pt-NPs与TMZ在兆伏X射线照射下对U87胶质母细胞瘤细胞的协同放射增敏作用。研究人员通过化学还原法合成了平均直径约121纳米、表面电位-42 mV的球形Pt-NPs，并证实其能有效被U87细胞摄取(约46%细胞显示内化)。研究采用MTT法确定了Pt-NPs和TMZ的亚毒性浓度(IC₁₀=55 μg/mL和IC₂₀=800 μM)，并设计了包括单药、双药和三联疗法的八组实验方案。

关键技术方法包括：通过扫描电镜(SEM)、动态光散射(DLS)和能量色散X射线光谱(EDX)表征纳米颗粒理化性质；采用共聚焦显微镜(CLSM)和流式细胞术分析细胞摄取；使用克隆形成实验评估放射敏感性；通过γ-H2AX免疫荧光检测DNA损伤；借助流式细胞术分析细胞凋亡和周期分布。所有实验均使用人胶质母细胞瘤U87细胞系(ATCC? HTB-14^TM)，辐照采用6 MV X射线光子束(2 Gy剂量)。

克隆存活分析

研究发现，三联合治疗几乎完全消除了U87细胞的克隆形成能力，存活分数(SF)降至0.03±0.04，显著低于所有单药和双药治疗组(p<0.001)。单独使用Pt-NPs或2 Gy照射仅使SF分别降至0.72和0.68，而TMZ单独治疗则显示出更强的细胞毒性(SF=0.45)。值得注意的是，Pt-NPs与照射联合产生了相加效应，而TMZ与照射联合则显示出协同趋势。三联合方案的卓越效果表明Pt-NPs、TMZ和辐射之间存在显著的协同相互作用。

DNA损伤响应

γ-H2AX免疫荧光染色结果与克隆形成实验高度一致。三联合治疗诱导了最显著的DNA双链断裂(DSBs)，γ-H2AX阳性细胞比例高达77.6±4.1%，显著高于所有对照组(p<0.05)。单独使用Pt-NPs可使γ-H2AX阳性率升至23.9±2.9%，而TMZ单独处理为52.45±4.2%。值得注意的是，Pt-NPs与TMZ联合即使在无照射条件下也能进一步增强DNA损伤(59.4±3.2%)，表明两种药物在诱导基因组不稳定性方面具有协同作用。

细胞凋亡诱导

凋亡分析显示，三联合治疗诱导了最高水平的细胞凋亡(32.1±0.75%)，显著高于TMZ+Pt-NPs组和其他所有处理组(p<0.01)。单独使用Pt-NPs或TMZ仅引起轻度凋亡(13.5±0.7%和15.4±2.4%)，而单独照射甚至未显著增加凋亡比例(4.7±5.8%)。流式细胞术点图分析证实，三联合治疗主要增加了早期凋亡细胞群体，表明该方案能有效启动程序性细胞死亡通路。

细胞周期分布

细胞周期分析揭示了治疗方案的独特机制。TMZ单独处理引起典型的G₂/M期阻滞(32.5±7.5%)，而Pt-NPs则导致S期累积(20.6±1.0%)。有趣的是，当Pt-NPs与TMZ联合时，TMZ诱导的G₂/M阻滞被显著抑制(降至5.4±1.3%)，同时S期细胞比例急剧上升至41.4±1.1%。三联合治疗进一步强化了这一趋势，使60.7±2.5%的细胞阻滞在S期，仅11.5±0.3%处于G₂/M期。这种细胞周期分布的显著紊乱表明Pt-NPs可能通过 override(覆盖)TMZ诱导的检查点激活，迫使受损细胞提前进入DNA合成期，从而增加基因组不稳定性。

讨论与结论

本研究首次在单一实验框架内系统评估了Pt-NPs与TMZ在兆伏X射线下的协同放射增敏效应。结果表明，三联合方案通过多重机制增强抗肿瘤效果：Pt-NPs的物理放射增敏作用(通过康普顿散射产生次级电子)和化学增敏作用(催化ROS生成)与TMZ的生物学效应(DNA烷基化)产生协同，导致DNA损伤的显著增加、细胞周期检查点的破坏以及凋亡的强烈诱导。

特别值得注意的是，Pt-NPs能够改变TMZ诱导的典型G₂/M期阻滞，促使细胞累积在S期。这种细胞周期重编程可能使DNA损伤的肿瘤细胞无法有效修复，从而增强辐射的细胞毒性作用。在兆伏能量范围内，Pt-NPs虽不像在千伏能量下那样主要通过光电效应发挥作用，但仍能通过康普顿产生的次级电子、光子能量下转换以及表面催化反应增强ROS产生，从而发挥放射增敏作用。

研究也存在若干局限性：仅使用MGMT(甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶)缺陷的U87细胞系，未涵盖GBM的分子异质性；仅测试单一辐射剂量(2 Gy)和固定药物浓度，无法建立完整的剂量反应关系；未直接测量ROS水平或DNA修复蛋白活性等关键机制指标。此外，所有分析仅在处理后24小时进行，可能无法完全捕捉动态治疗响应。

尽管存在这些限制，该研究为Pt-NPs作为GBM放射增敏剂的临床应用提供了有力的临床前证据。未来研究需要扩展到MGMT阳性及其他耐药细胞系，纳入多个辐射剂量以计算放射增敏比(SER)，并开展体内实验验证其血脑屏障穿透性和治疗效果。这项研究为开发针对GBM的协同纳米治疗策略奠定了重要基础，有望为这种致命疾病患者带来新的治疗希望。