基于铜死亡基因集的冠状动脉疾病血液生物标志物鉴定与诊断模型构建

《European Journal of Medical Research》：Identification of potential blood biomarkers of coronary artery disease using a cuproptosis gene set

本研究针对冠状动脉疾病(CAD)早期诊断难题，通过整合GEO数据库全血转录组数据（GSE180081/GSE180082），首次利用19个铜死亡（cuproptosis）相关基因对521例CAD患者进行聚类分析，发现818个铜死亡相关差异表达基因。通过LASSO回归筛选出HIST1H4E、IL6ST、LST1等5个关键基因构建诊断模型（AUC=0.83），并在独立队列中验证了这些基因与免疫细胞浸润的密切关联。研究成果为CAD的早期预测提供了新型血液生物标志物和个体化治疗新靶点。

　　

在全球范围内，冠状动脉疾病（CAD）始终是导致死亡的首要原因，尤其在发展中国家形势更为严峻。这种疾病主要源于冠状动脉粥样硬化以及急性血管闭塞，其发病机制涉及一系列复杂的病理过程，包括脂质浸润、氧化应激导致的内皮损伤、炎症激活、血管平滑肌细胞增殖，以及最终导致动脉粥样硬化斑块形成的进行性纤维化重塑。斑块的进展可能引发官腔严重狭窄，或通过破裂/侵蚀触发急性血栓形成，最终导致心肌缺血和不可逆的坏死。目前，阿司匹林、他汀类药物和β-受体阻滞剂被广泛用于CAD的一级和二级预防，严重病例则需要接受支架植入或冠状动脉旁路移植术（CABG）。然而，长期服药和反复介入治疗显著影响患者的生活质量，因此，开发基于血液的生物标志物和强大的预测模型，以实现高危人群的早期识别，成为当前迫切的临床需求。

铜作为多种关键酶的辅助因子，其稳态失衡可引发免疫失调。铜死亡（cuproptosis）是近期发现的一种程序性细胞死亡形式，由线粒体三羧酸（TCA）循环中的铜离子过载驱动，导致酰化蛋白聚集和铁硫簇蛋白下调，进而诱导蛋白毒性应激和细胞死亡。考虑到免疫反应在CAD中的核心作用，以及铜死亡与免疫的密切联系，研究人员推测铜死亡相关基因可能参与CAD的发病机制，并具有作为潜在生物标志物的价值。

为此，发表在《European Journal of Medical Research》上的这项研究进行了一项深入分析。研究人员从GEO数据库获取了GSE180081和GSE180082两个数据集的全血转录组图谱，包含521例CAD患者和191例对照样本。数据经过批次效应校正和分位数标准化后，利用Limma包识别CAD组与对照组之间的差异表达基因（DEGs）。随后，研究团队使用19个铜死亡基因对CAD患者进行共识聚类（ConsensusClusterPlus），将其分为高铜死亡活性和低铜死亡活性两组，并鉴定两组间的DEGs。将这些DEGs与CAD相关的DEGs取交集，得到818个铜死亡相关的CAD差异表达基因（Co-DEGs）。通过LASSO回归从Co-DEGs中筛选特征基因，并利用逻辑回归构建诊断模型。此外，研究还进行了免疫浸润分析、竞争性内源RNA（ceRNA）网络构建、药物靶点预测，并在一项独立队列（12例CAD，12例对照）中通过RT-qPCR对关键基因的表达趋势进行了局部验证。

研究结果揭示，Co-DEGs主要富集于细胞活化正调控、白细胞活化正调控、actin filament organization、白细胞细胞粘附以及淋巴细胞活化正调控等通路，表明这些基因与免疫功能，特别是白细胞活化和相互作用密切相关。KEGG分析显示Co-DEGs主要与感染性疾病相关。基因集富集分析（GSEA）进一步表明这些基因富集于顶端连接（Apical junction）、补体（Complement）和缺氧（Hypoxia）等通路。

通过LASSO回归筛选，研究最终确定了一个由五个基因（HIST1H4E, IL6ST, LST1, RN7SKP45, SNORD50B）组成的诊断特征。基于这五个基因构建的逻辑回归诊断模型在训练集（GSE180081）中表现出色，曲线下面积（AUC）达到0.83。在测试集（GSE180082）中，模型的AUC为0.62。决策曲线分析表明该模型具有临床实用性。

免疫景观分析

根据诊断模型的风险评分将样本分为高危组和低危组后，免疫浸润分析揭示了显著的差异。单样本基因集富集分析（ssGSEA）显示，高危组中28种免疫细胞类型中的13种（除活化的CD4⁺ T细胞外）浸润水平更高。ESTIMATE算法计算出的免疫评分在高危组中也显著更高。Cibersort分析则发现高危组中记忆性CD4⁺ T细胞数量较低。这些结果一致表明，高危CAD患者具有更强的免疫活动状态。此外，五个特征基因均与多种免疫细胞功能密切相关，其中LST1基因与20种免疫细胞相关，提示其可能是未来研究的关键候选基因。

特征基因的功能关联

相关性分析表明五个特征基因之间无密切关联，排除了多重共线性对模型的干扰。差异表达分析确认在CAD组中，这五个基因均呈低表达。单基因GSEA分析显示，这些基因与白细胞跨内皮迁移、I型糖尿病、病毒性心肌炎、致心律失常性右心室心肌病、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢等心血管疾病和炎症调控通路相关。进一步分析发现，HIST1H4E和LST1的表达与免疫抑制基因（如BTLA, TMEM173）、免疫激活基因（如CD276）以及MHC相关基因（如TAPBP）密切相关，提示其表达可能受免疫调节网络的影响。

ceRNA网络与靶向药物预测

鉴于RN7SKP45（假基因）和SNORD50B（非编码RNA）的局限性，研究后续聚焦于HIST1H4E、IL6ST和LST1这三个蛋白编码基因。通过整合MicroCosm和starBase数据库信息，构建了包含59个节点（3个基因，47个miRNA，9个lncRNA）的ceRNA调控网络。其中，LST1受到27个miRNA的潜在调控，主要关联的lncRNA包括DANCR、NEAT1和SNHG22；IL6ST受15个miRNA调控；HIST1H4E受6个miRNA调控，如miR-148a-3p。利用DGIdb数据库，研究还预测了靶向IL6ST的三种药物和靶向LST1的一种药物，为后续干预研究提供了线索。

实验验证

为了验证生物信息学分析结果，研究团队收集了12例CAD患者和12例健康对照的外周血样本，从中分离外周血单核细胞（PBMCs），并通过RT-qPCR检测了LST1、IL6ST和HIST1H4E的表达水平。结果证实，与对照组相比，CAD患者中LST1和HIST1H4E的表达显著降低，这与转录组数据分析趋势一致。然而，IL6ST在CAD组中的表达却显著升高，这一发现值得进一步探究。该实验结果初步支持了LST1、HIST1H4E和IL6ST作为CAD潜在生物标志物的可能性。

综上所述，本研究首次将铜死亡机制与冠状动脉疾病（CAD）的发病机制相联系，利用生物信息学分析和实验验证，筛选并初步验证了HIST1H4E、IL6ST和LST1作为CAD诊断新型血液生物标志物的潜力。所构建的诊断模型为CAD的早期识别提供了新工具。研究结果不仅揭示了铜死亡相关基因在CAD免疫微环境调控中可能扮演的角色，还通过ceRNA网络和靶向药物预测，为后续深入探索CAD的发病机制和开发个体化治疗策略奠定了重要的理论基础和实验依据。尽管存在回顾性分析可能带来的选择偏倚以及验证队列规模有限的不足，但这项研究为基于铜死亡概念的CAD风险预测、预防和精准治疗开辟了新的方向。