亨廷顿病脑内自噬-溶酶体通路病理生物学研究：揭示疾病进展中mHTT清除机制的时间依赖性变化

《Acta Neuropathologica Communications》：Pathobiology of the autophagy-lysosomal pathway in the Huntington’s disease brain

本研究针对亨廷顿病(HD)中突变亨廷顿蛋白(mHTT)清除机制不明确的问题，通过多模态分析揭示了自噬-溶酶体通路(ALP)在人类HD脑中的动态变化。研究发现早期HD阶段ALP功能完整，而晚期阶段出现溶酶体病理和mHTT积累，为HD治疗时间窗提供了重要依据，支持早期ALP干预策略。

　　

在神经退行性疾病研究领域，亨廷顿病(HD)作为一种致命的遗传性神经疾病，一直困扰着科学界和患者家庭。这种疾病由亨廷顿蛋白(HTT)基因突变引起，导致突变亨廷顿蛋白(mHTT)在神经元内异常积累，形成毒性聚集体。随着疾病进展，患者大脑特定区域（尤其是纹状体）的神经元逐渐死亡，引起运动协调障碍、认知功能下降和精神症状。

尽管科学界早已认识到mHTT的异常积累是HD发病的核心环节，但大脑自身清除这些异常蛋白的机制如何随着疾病进展而变化，却一直是未解之谜。自噬-溶酶体通路(ALP)作为细胞内重要的"清洁系统"，负责降解长寿蛋白、受损细胞器和蛋白聚集体，被认为是清除mHTT的关键途径之一。然而，大多数关于HD中ALP功能的认识来自于细胞或动物模型研究，在真实的人类HD大脑中，这一系统究竟处于什么状态？是在疾病早期就出现功能障碍，还是随着疾病进展逐渐衰竭？这些问题对于开发有效的治疗策略至关重要。

为了解决这些关键问题，由Martin J. Berg、Veeranna、Corrinne M. Rosa和Asok Kumar等研究人员组成的团队在《Acta Neuropathologica Communications》上发表了他们的最新研究成果。这项研究首次在人类HD脑组织中对ALP进行了全面、系统的评估，涵盖了从早期到晚期的不同疾病阶段。

研究人员采用了多学科交叉的研究策略，主要技术方法包括：利用来自哈佛脑组织资源中心(HBTRC)、埃默里神经退行性疾病中心(ECND)等脑库的死后人脑组织（按Vonsattel分级标准分为HD2-HD4期和对照组）；通过免疫组织化学和免疫荧光技术在纹状体(STR)、前额叶皮质(CTX)和小脑(CBM)中检测ALP相关标志物；运用透射电子显微镜进行超微结构分析；采用蛋白质印迹法(Western blot)定量分析关键蛋白表达；通过实时定量PCR(qPCR)检测基因转录水平；以及使用酶活性测定方法评估溶酶体水解酶功能。

HTT包涵体：类型及其与自噬适配蛋白Ub和p62的密切关系

研究首先详细描述了HD大脑中各种类型的mHTT包涵体。通过电子显微镜观察，研究人员在纹状体和皮质神经元核内发现了单个离散的卵圆形或不规则形状的核内包涵体(NII)，直径1-4微米，由相对均匀的颗粒状或短纤维元素组成的网状结构构成，而在对照大脑中未检测到此类结构。

免疫标记显示，HTT/mHTT定位于自噬相关适配蛋白sequestosome 1(p62/SQSTM1)、泛素(Ub)和组织蛋白酶D(CTSD)标记的ALP囊泡区室中。双重免疫荧光标记检测到核内p62免疫反应性(IR)和Ub-IR高度共定位。另一种主要的包涵体类型是神经突包涵体，随机分布在神经纤维网中，同样可被抗mHTT、抗Ub和抗p62抗体标记。超微结构分析突出了神经纤维网中存在的三种包涵体：最常见的是1-8微米球形包涵体，无明显的限制膜；第二种是0.5-2.0微米膜结合球形结构，包含多个较小的指纹状轮廓；第三种是最不常见的细长或彗星形结构。

HD大脑中选定ALP相关靶点的qPCR分析

研究人员接下来检测了ALP相关基因的转录水平。qPCR结果显示，皮质p62(SQSTM1)表达与疾病严重程度呈显著正相关，而纹状体和皮质中ATG7和LC3b的表达趋势向上，但小脑中这些自噬诱导或货物标记物的表达呈负相关。溶酶体生物发生的转录激活因子表现与AD脑中的结果相似，TFEB水平呈上升趋势，而TFE3表现相反。组织蛋白酶D(CTSD)在皮质中与疾病显著相关，但在纹状体中显著下降。这些数据表明，在疾病进展过程中，与自噬底物清除相关的后期阶段存在轻度改变。

HTT蛋白和适配蛋白p62、TRAF6和Ub的免疫印迹分析

免疫印迹分析揭示了这些蛋白质在区域特异性模式。完整的HTT蛋白水平在HD病例的纹状体中大大降低（早在HD2阶段），而皮质中对照组和HD病例之间该HTT种类的水平差异仅边缘性显著。纹状体中完整HTT的下降伴随着45-48 kDa N末端HTT片段的显著积累，而此类片段在皮质中基本不存在。

p62和TRAF6两种适配蛋白的免疫印迹分析显示，这些蛋白质也产生了蛋白水解片段(32-48 kDa)，这些片段在HD纹状体中选择性增加，水平接近对照组的四倍。泛素化分析显示，纹状体中K⁴⁸和K⁶³泛素化显著增加，总泛素化呈强劲上升趋势(p=0.06)，皮质中仅K48泛素化显著增加，而小脑基本无变化。

CTSD免疫标记揭示ALP病理在疾病晚期发展

通过组织蛋白酶D(CTSD)的免疫组织化学(IHC)评估HD大脑中ALP的状态。抗CTSD抗体在对照组病例中标记了皮质多个层中的许多锥体神经元，带有小的阳性点。HD2阶段的大脑切片表现出与对照组相似的CTSD标记模式，表明在疾病进展的早期阶段不存在溶酶体病理。然而，在HD4阶段的切片中观察到异常的染色模式，表现为神经元胞体中更强、成团的管腔染色，特别是在基底极，以及整体的斑片状染色模式。

在纹状体中，对照组切片的神经元CTSD染色模式明显正常，尽管有一些小的成团染色，而HD4阶段明显表现出异常的染色模式，反映为神经元胞体或神经纤维网中强烈染色的点和点团。与皮质相比，HD大脑纹状体中的溶酶体病理更为严重。LC3（ALP的另一个标记物）的免疫标记显示，神经元在对照组和HD纹状体中的染色（弥漫性和点状），但即使在HD4阶段，除了对照组大脑中看到的一些神经元被更强但弥漫性标记的范围外，没有明显变化。

疾病进展过程中mHTT信号与CTSD免疫反应性的关联

考虑到溶酶体病理在HD大脑中出现在病理晚期，研究人员接下来评估了溶酶体异常与潜在底物（如HTT）通过自噬过程到达溶酶体的可能关系。对照组病例纹状体神经元的CTSD和HTT(mEM48)双重免疫标记显示中等染色的CTSD点。HD神经元显示mHTT免疫标记，被CTSD环绕。在HD4阶段，通过荧光标记明显看到斑片状CTSD染色模式，许多细胞中的CTSD和/或HTT阳性囊泡变得巨大并成簇。

HD4阶段，神经纤维网中的HTT阳性包涵体数量多且通常更大，与CTSD免疫反应性点共定位或被其包围，表明HTT包涵体太大而无法包含在单个自噬溶酶体内。晚期HD大脑受累神经元中的溶酶体病理涉及CTSD阳性囊泡的积累，这些囊泡被HTT装饰并集中在神经元的一极，这种分布模式与脂褐素颗粒相关。

细胞质囊泡细胞器的进一步超微结构分析

进一步的电子显微镜分析验证了这些结构的发生率，并进一步评估了自噬相关或不相关的囊泡结构。细胞质中含有各种自噬泡(AV)和丰富的脂褐素颗粒，反映了溶酶体底物降解不完全。特别值得注意的是，在一些受累神经元中出现了单层膜限制的300-500纳米囊泡的集合，内容相对均匀，主要是颗粒状和纤维状物质，与上述大型纤维状细胞质包涵体的成分类似。

在营养不良的神经突中，自噬泡清晰可见，表现为双层膜限制的空泡（自噬体）或多层膜体(MLB)，含有低电子密度的管腔内内容物，表明自噬货物沿ALP成功隔离和输送。值得注意的是，不同大小的透明囊泡簇，其特征是管腔内内容物极少（即"空"），其中大多数是单层膜限制，而一些表现出双层膜外观，提出了后者代表由于货物隔离缺陷导致的"空自噬体"的可能性。

溶酶体标记物的免疫印迹提示纹状体中溶酶体生物发生上调

为了调查ALP相关生化变化，研究人员在HD2-HD4分期大脑和对照组中分析了ALP不同阶段的蛋白标记物（即自噬诱导信号、自噬泡形成和溶酶体底物清除）。值得注意的是，ALP早期阶段的大多数标记蛋白，包括p-p70S6（作为mTOR抑制的指标）、BECN1、ATG5、ATG7和LC3，在这些区域中随着疾病进展没有表现出明显变化，与上述qPCR结果一致。

对于溶酶体降解功能相关的标记物，研究人员没有观察到参与底物清除的溶酶体酶CTSD和CTSB的蛋白水平（图7A、B、D、E）和酶活性（图7C、F）的显著改变。然而，一个有趣的观察是HD大脑纹状体中LAMP1水平升高，早在HD2阶段就出现，而在皮质中没有观察到，突出了CTSD免疫组织化学在HD纹状体中发现的疾病严重程度水平，而皮质程度较轻，而qPCR显示一致性有限。

研究结论与意义

这项研究提供了关于人类HD大脑中ALP状态的全面、多层次分析，揭示了疾病不同阶段的关键变化。最重要的发现是，在HD早期阶段，自噬-溶酶体通路保持相对完整的功能状态，能够有效清除mHTT；而在疾病晚期，随着mHTT积累的加剧，溶酶体系统逐渐不堪重负，出现明显的病理改变。

从治疗角度来看，这些发现具有重要的临床意义。早期HD阶段ALP功能的完整性为治疗干预提供了宝贵的时间窗口，此时通过药物手段刺激自噬流可能有效促进mHTT的清除，延缓疾病进展。相比之下，在疾病晚期，当溶酶体系统已经出现明显功能障碍时，同样的治疗策略可能会因加重系统负担而产生反效果。

与阿尔茨海默病(AD)中自噬功能早期就出现严重障碍不同，HD中相对完整的早期自噬功能为针对性治疗提供了独特机会。研究结果支持在HD早期症状阶段使用自噬诱导剂（如mTOR抑制剂）的治疗策略，这一观点在Q175亨廷顿病模型小鼠实验中已得到初步验证。

该研究还系统分类和描述了HD大脑中的各种包涵体类型，为理解mHTT聚集的病理过程提供了重要线索。不同类型包涵体的超微结构特征表明，mHTT可能以不同的形态状态聚集，这些状态在特定条件下可能相互转换。

综上所述，这项研究不仅深化了对亨廷顿病病理机制的理解，而且为开发针对自噬-溶酶体通路的时序治疗策略提供了重要理论依据，对神经退行性疾病的治疗研究具有广泛的借鉴意义。