小鼠脑室管膜糖萼随年龄和脑室内出血的动态重塑：结构、糖组学与转录组学整合研究

《Fluids and Barriers of the CNS》：Age?dependent and post?intraventricular hemorrhage remodeling of the ependymal glycocalyx in mice

本研究聚焦于脑室管膜糖萼（Gcx）这一关键但研究不足的脑-脑脊液屏障结构。研究人员针对其在生理性衰老和急性脑损伤（如脑室内出血，IVH）中的结构完整性和糖链组成变化，开展了系统的组织化学、超微结构和单细胞转录组学分析。结果揭示，年轻小鼠的管膜Gcx富含唾液酸（Sia）和半乳糖终止的糖链；而衰老导致Gcx显著变薄、脱落，并伴有末端唾液酸丢失和核心1 O-糖链合成酶（C1GALT1/C1GALT1C1）下调。IVH后，Gcx急性损伤与脑室周围炎症相关，且老年小鼠的炎症消退延迟。该研究为理解Gcx在维持脑内环境稳定中的作用及开发针对年龄相关神经退行性疾病的糖生物学治疗策略提供了新见解。

　　

在我们大脑的深处，有一个充满脑脊液（Cerebrospinal Fluid, CSF）的腔室系统，它犹如大脑内部的“运河系统”，负责营养输送、废物清除和保护缓冲。衬在这些脑室表面的，是一层被称为室管膜（Ependyma）的细胞。这些细胞的顶端表面覆盖着一层毛茸茸的“糖衣”，即室管膜糖萼（Glycocalyx, Gcx）。这层糖衣主要由复杂的糖链（聚糖）和蛋白质构成，它不仅是物理屏障，防止有害物质进入脑组织，其表面的负电荷还可能像润滑剂一样，帮助脑脊液顺畅流动，并参与细胞信号识别。然而，这层至关重要的“糖衣”在自然衰老过程中会发生什么变化？当大脑遭遇急性损伤，如脑室内出血（Intraventricular Hemorrhage, IVH）时，它又会如何响应？这些变化对大脑健康有何影响？长期以来，这些问题由于技术手段的限制而缺乏系统解答。

发表在《Fluids and Barriers of the CNS》上的一项最新研究，首次对小鼠脑室管膜糖萼进行了全面“测绘”。研究人员综合运用了多种先进技术：包括利用镧增强的扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）直观显示Gcx的超微结构；通过一组包含21种不同糖结合特异性的荧光凝集素（Lectin）进行双标免疫荧光染色，精细绘制了Gcx的糖链组成“图谱”；并开发了一种基于荧光强度曲线拐点距离的图像分析方法，首次实现了对Gcx厚度的客观量化。为了模拟急性脑损伤，研究团队建立了小鼠IVH模型，通过向侧脑室注射自体全血，观察Gcx的动态变化。此外，研究者还对公共数据库中的9406个小鼠室管膜细胞进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）整合分析，从转录组层面揭示衰老相关的基因表达变化。实验对象为野生型C57BL/6J小鼠，分为年轻成年组（8-10周龄）和老年组（60-62周龄）。

研究结果

年轻小鼠室管膜Gcx的可视化与糖链谱分析

研究人员首先成功“点亮”了这层神秘的糖衣。在常规电镜下，Gcx难以显现，但通过镧染色后，扫描电镜（SEM）清晰地显示出Gcx像一层致密的绒毛，覆盖在室管膜细胞顶面和纤毛周围。Alcian blue染色和低真空SEM（LVSEM）则提供了Gcx覆盖纤毛基部的三维视图。

关键的发现来自于21种凝集素的筛选。双标免疫荧光染色（S100β标记室管膜细胞）显示，年轻小鼠的室管膜Gcx含有丰富的特定糖链结构。其中，番茄凝集素（Lycopersicon esculentum Lectin, LEL）、蓖麻凝集素I（Ricinus communis Agglutinin I, RCA-I）、特异性识别α2,3连接唾液酸的SiaFind、马铃薯凝集素（Solanum tuberosum Lectin, STL）、曼陀罗凝集素（Datura stramonium Lectin, DSL）和花生凝集素（Peanut Agglutinin, PNA）产生了强烈的信号。值得注意的是，在没有使用神经氨酸酶（去除唾液酸）处理的情况下，Gcx就显示出PNA阳性，这表明其表面存在未被唾液酸封端的Galβ(1,3)GalNAc结构（即T抗原），这与血管内皮Gcx的特性不同，暗示了室管膜Gcx在分子交换方面的独特适应性。

衰老相关的室管膜Gcx结构与组成改变

衰老对Gcx造成了显著影响。与年轻小鼠相比，老年小鼠的Gcx在形态上明显变薄，并且出现大范围脱落。定量分析显示，Gcx沿着脑室周缘的覆盖率从年轻时的77.25%急剧下降至33.06%。透射电镜（TEM）图像证实了这种结构上的退化：年轻小鼠Gcx完整覆盖细胞顶面、微绒毛和纤毛，而老年小鼠则出现局部缺失。

研究人员采用创新的方法——通过分析凝集素（标记Gcx）和S100β（标记细胞膜）荧光强度曲线的拐点距离来量化Gcx厚度（包含微绒毛）。该方法与直接测量结果高度相关，验证了其可靠性。应用此法发现，老年小鼠对于LEL、PNA和RCA-I的Gcx厚度均显著减小。此外，糖链组成也发生改变，许多凝集素信号减弱，尤其是SiaFind和LEL，提示末端唾液酸和多聚N-乙酰乳糖胺结构的丢失。更引人注目的是，在老年室管膜细胞的胞浆内出现了PNA阳性信号，而年轻小鼠中几乎没有，这表明衰老导致某些糖链在细胞内异常滞留。

IVH后室管膜Gcx的动态变化

在IVH模型中，Gcx遭受了急性损伤。Alcian blue和PNA染色显示，IVH后Gcx迅速变薄和脱落。损伤在第三天达到高峰（覆盖率降至24.3%），到第七天时有部分恢复，但未能回到正常水平。Gcx厚度在损伤后第1天到第7天持续低于假手术组。

IVH引发了脑室周围炎症，表现为小胶质细胞标志物Iba-1信号增强以及室管膜细胞内Galectin-3表达上调，同时脉络丛上的Kolmer细胞（巨噬细胞样细胞）体积增大。在年轻小鼠中，这些炎症指标在第1-3天达到峰值后，于第7天有所减弱。然而，在老年IVH小鼠中，无论是脑室周围的Iba-1信号还是室管膜Galectin-3表达，在第7天均未出现明显消退，Kolmer细胞体积甚至显著大于年轻对照组，表明老年大脑在IVH后出现了持续性的炎症反应。

整合单细胞转录组学揭示老年室管膜细胞的多层次分子重塑

为了深入探究衰老的分子机制，研究者对公共单细胞RNA测序数据进行了整合分析。结果揭示了老年室管膜细胞在糖链生物合成、唾液酸化、去唾液酸化、囊泡运输和炎症反应等相关基因集的显著改变。

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  糖链代谢失衡：唾液酸转运蛋白SLC35A1表达下降。在唾液酸转移酶家族中，ST3GAL1下调，而ST3GAL5上调。负责核心1 O-糖链合成的关键酶C1GALT1及其分子伴侣C1GALT1C1均下调。在去唾液酸化酶（唾液酸酶，Neuraminidase）中，主要位于溶酶体和胞浆的NEU1和NEU2减少，而位于质膜的NEU3增加，提示膜表面去唾液酸化活动可能相对增强。
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  囊泡运输改变：涉及膜运输的Rab GTP酶中，RAB6A和RAB8A表达降低，而RAB11A和RAB11B在表达细胞比例降低的同时，每个细胞的平均表达量却升高，表明囊泡运输通路发生了复杂重组。
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  炎症与衰老信号激活：细胞衰老经典标志物如Cdkn1a和Trp53，以及一系列干扰素刺激基因（Ifit1, Ifit3, Oasl2, Isg15, Rsad2, Mx2, Stat1等）在老年细胞中显著上调，揭示了衰老相关的炎症状态（即“炎症衰老”）。

结论与意义

本研究系统描绘了小鼠脑室管膜糖萼的糖链组成图谱，并首次揭示了其在生理性衰老和IVH急性损伤下的动态重塑规律。

研究结论可概括为：室管膜Gcx是一个动态且对损伤敏感的结构。在年轻状态下，它富含唾液酸化糖链，构成一道功能性的脑-CSF屏障。衰老导致Gcx变薄、脱落、糖链组成改变（特别是末端唾液酸丢失），并伴随细胞内糖链代谢和运输基因的转录失调以及炎症和衰老信号的激活。IVH会引起Gcx急性损伤和神经炎症，而老年大脑则表现出炎症消退延迟和Gcx修复受损。这些Gcx的破坏可能通过损害屏障功能、扰乱CSF流动、破坏细胞间粘附与信号传导以及暴露“自我”标志引发免疫反应等多种机制，共同促进脑室周围炎症、脑积水（Hydrocephalus）和神经退行性病变的发生发展。

该研究的深远意义在于它将神经科学和糖生物学这两个前沿领域紧密联系起来，提出了“糖码”（Glycocode）的概念——即细胞表面糖链的变化能够反映并影响细胞的生理病理状态。这为理解大脑衰老和损伤的机制提供了全新视角。更重要的是，研究指出针对糖基化通路（Glycosylation Pathways）的治疗性调控，例如通过药物干预维持或恢复Gcx的完整性，可能成为延缓年龄相关性神经退行性进程或促进脑损伤后修复的潜在新策略，为未来开发神经保护疗法开辟了充满希望的新方向。