BPTF-665aa介导染色质重塑驱动T-LBL/ALL化疗耐药的新机制及靶向抑制剂发现

《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》：BPTF-665aa mediate chromatin remodeling drives chemoresistance in T-LBL/ALL

本研究针对T细胞淋巴母细胞淋巴瘤/白血病(T-LBL/ALL)化疗耐药难题，通过转录组分析发现circBPTF在耐药样本中显著高表达。研究人员深入探讨了其编码蛋白BPTF-665aa通过稳定全长BPTF、增强c-Myc P2启动子区域染色质可及性，进而促进化疗耐药的分子机制，并筛选出小分子抑制剂HY-B0509。该研究为克服T-LBL/ALL化疗耐药提供了新的潜在治疗靶点。

　　

在血液系统恶性肿瘤领域，T细胞淋巴母细胞淋巴瘤/白血病(T-cell lymphoblastic lymphoma/leukemia, T-LBL/ALL)是一种起源于未成熟T细胞前体的高度侵袭性肿瘤。尽管采用美国国立综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network, NCCN)推荐的高强度化疗方案初期有效，但仍有40%-60%的患者面临治疗耐药和复发，导致预后极差，这成为临床治疗中的主要挑战。除了NOTCH1、FBXW7和NRAS/KRAS等 recurrent genetic mutations，表观遗传学修饰，包括DNA甲基化、组蛋白修饰和长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)，在肿瘤进展和耐药中的作用日益受到关注，但其在T-LBL/ALL化疗耐药中的具体机制尚不明确。

环形RNA(circular RNA, circRNA)因其稳定的共价闭合环状结构，能够抵抗核酸外切酶降解，在癌症中扮演着重要角色。它们通过吸附microRNA、与RNA结合蛋白相互作用或作为蛋白质翻译的模板来影响多种致癌通路。然而，circRNA在T-LBL/ALL化疗耐药中的作用却鲜有报道。

Chen等人发表在《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》上的研究，首次通过转录组测序发现circBPTF在化疗耐药的T-LBL/ALL样本中显著上调。进一步功能实验证实，circBPTF编码的蛋白质BPTF-665aa是介导耐药的关键因子。值得注意的是，BPTF-665aa不仅能阻止全长BPTF的泛素化降解，还能通过其植物同源结构域(Plant Homeodomain, PHD) finger和Bromodomain等关键基序，促进关键启动子区域（如c-Myc promoter 2, P2）的染色质可及性(chromatin accessibility)，从而激活对细胞生存和增殖至关重要的转录程序。此外，研究团队通过虚拟筛选(virtual screening)和分子动力学模拟(molecular dynamics simulations)，鉴定出小分子化合物HY-B0509能够稳定结合BPTF-665aa的活性位点，为靶向治疗提供了潜在策略。该研究揭示了一个全新的机制：circRNA来源的蛋白质通过调控染色质结构驱动化疗耐药，确立了BPTF-665aa作为T-LBL/ALL治疗的潜在新靶点。

为开展此项研究，作者运用了多项关键技术：收集了来自两个中心的166例符合WHO 2022标准的儿科T-LBL/ALL患者样本，并依据化疗反应情况分为耐药组和敏感组进行circRNA测序分析；通过RNase R消化、反向PCR和Sanger测序验证了circBPTF的环状结构；利用FLAG标签标记、Western blot、核质分离和免疫荧光技术检测了BPTF-665aa蛋白的表达、稳定性及亚细胞定位；通过慢病毒介导的shRNA敲低和过表达质粒，在细胞系（SUP-T1、Jurkat、K-562）和患者来源异种移植(patient-derived xenograft, PDX)模型中评估了circBPTF/BPTF-665aa对化疗药物敏感性（通过CCK-8检测IC₅₀和流式细胞术检测凋亡）的影响；采用染色质免疫沉淀定量PCR(Chromatin Immunoprecipitation quantitative PCR, ChIP-qPCR)和荧光素酶报告基因实验分析了BPTF-665aa对c-Myc P2启动子活性和组蛋白修饰（H3K4me3, H3K27ac）的影响；通过Co-Immunoprecipitation(Co-IP)探究了BPTF-665aa与全长BPTF的相互作用及对泛素化的影响；最后，通过虚拟筛选和分子动力学模拟筛选并验证了靶向BPTF-665aa的小分子抑制剂HY-B0509。

Characterization of circular structure and functional potential of circBPTF

研究人员对4例化疗耐药和4例化疗敏感的T-LBL/ALL样本进行circRNA测序，发现circRNA.3579（即circBPTF）在耐药组中显著高表达。circBPTF是由BPTF基因的第21至27号外显子反向剪接形成，长度为2026个核苷酸。RNase R消化实验和针对反向剪接接头的特异性引物PCR证实了其环状结构。生物信息学分析预测circBPTF包含一个1998 bp的开放阅读框(open reading frame, ORF)，编码一个由665个氨基酸组成的蛋白质，即BPTF-665aa。通过FLAG标签标记和Western blot，在细胞中成功检测到BPTF-665aa蛋白的表达，且其表达水平在耐药患者样本中显著高于敏感样本。亚细胞定位显示circBPTF主要位于细胞质，支持其蛋白编码功能。

Expression, prognostic value, and role in chemoresistance of circBPTF

根据circBPTF表达中位数将患者分为高表达组和低表达组。Kaplan-Meier生存分析显示，无论是在训练队列还是验证队列中，circBPTF高表达患者的总体生存期(overall survival, OS)和无进展生存期(progression-free survival, PFS)均显著缩短。在SUP-T1和K-562细胞中，利用靶向circBPTF反向剪接接头的shRNA（shCirc-1和shCirc-2）特异性敲低circBPTF后（对线性BPTF mRNA无影响），BPTF-665aa蛋白水平下降，细胞对阿霉素(doxorubicin, Dox)的敏感性增加（IC₅₀降低），凋亡率升高。这表明circBPTF的高表达与T-LBL/ALL的不良预后和化疗耐药相关。

BPTF-665aa exerts a protein-centric role in chemoresistance

为了区分circBPTF的RNA功能与其编码蛋白的功能，研究人员构建了三种质粒：野生型(WT，可形成circRNA并翻译蛋白)、突变型(Mut，IRES区突变，可形成circRNA但不翻译蛋白)和ORF型（仅编码BPTF-665aa蛋白的线性序列，不形成circRNA）。实验结果表明，过表达WT和ORF（均能表达BPTF-665aa蛋白）的细胞对Dox的耐药性显著增强，凋亡减少；而过表达Mut（仅表达circRNA）的细胞表型与对照无异。在小鼠移植瘤模型中，过表达ORF的肿瘤细胞在Dox治疗后生长更快。这些结果证明BPTF-665aa蛋白是介导化疗耐药的核心因素，其作用独立于circRNA本身。

Dual roles of BPTF-665aa in protein stability and nuclear regulation

环己酰亚胺(cycloheximide, CHX)追踪实验表明，BPTF-665aa的半衰期短于全长BPTF。然而，在过表达circBPTF（即同时存在BPTF-665aa）的细胞中，全长BPTF的降解速度减慢。Co-IP实验发现，BPTF-665aa能与全长BPTF相互作用，并减少其泛素化水平，提示BPTF-665aa通过竞争性结合泛素化系统来稳定全长BPTF。亚细胞分级显示BPTF-665aa定位于细胞质和细胞核。结构模拟预测BPTF-665aa含有与染色质结合相关的PHD finger和Bromodomain等保守结构域，为其核功能提供了结构基础。

BPTF-665aa-mediated chromatin accessibility at the P2 promoter drives c-Myc activation and chemoresistance

对公共数据库（ChIP-Atlas, GEO）的分析发现，c-Myc基因座chr8:127734062-127734131区域具有高转录活性和染色质可及性，富含H3K4me3、H4ac等活性组蛋白标记，被注释为活性启动子（c-Myc P2）。Hi-C数据显示该区域位于一个拓扑关联域(topologically associating domain, TAD)内，存在染色质环，利于转录调控。实验证实，过表达BPTF-665aa或circBPTF能显著上调c-Myc的mRNA和蛋白水平。ChIP-qPCR显示BPTF-665aa以及H3K4me3和H3K27ac在c-Myc P2区域富集。荧光素酶报告基因实验也证实BPTF-665aa能增强P2启动子的转录活性。相反，敲低circBPTF则得到相反的效果。这表明BPTF-665aa通过促进c-Myc P2区域的染色质可及性和组蛋白修饰，激活c-Myc转录，进而驱动耐药。

Virtual screening and molecular dynamics simulations identify HY-B0509 as a BPTF-665aa inhibitor

利用SWISS-MODEL基于AlphaFold模板（A0A7K7W5R3.1）构建了BPTF-665aa的结构模型。通过对MCE化合物库（5万多样性库和生物活性库）进行虚拟筛选，重点关注了活性位点关键残基（如ILE596, VAL584）。经过标准精度和超精度对接以及AutoDockTools的进一步筛选，小分子HY-B0509以较高的结合自由能（ΔG = -7.6139 kcal/mol）脱颖而出。分子动力学模拟（50 ns）显示，HY-B0509与BPTF-665aa复合物的均方根偏差(root mean square deviation, RMSD)和均方根涨落(root mean square fluctuation, RMSF)均较稳定，氢键数量和溶剂可及表面积(solvent-accessible surface area, SASA)也保持相对稳定，表明二者结合稳定。相互作用分析显示HY-B0509与ASP585、ASN635、GLU582形成氢键，并与PRO583、PRO579等残基存在疏水作用。

研究结论与意义

本研究首次系统地揭示了circRNA来源的蛋白质BPTF-665aa在T-LBL/ALL化疗耐药中的核心作用。其创新性在于发现了一条全新的调控通路：circBPTF编码的BPTF-665aa一方面在细胞质中通过抑制泛素化降解来稳定全长BPTF蛋白，另一方面进入细胞核，利用其保守的染色质结合结构域，直接增强c-Myc等重要癌基因启动子区域的染色质可及性，从而激活促生存转录程序。这一发现将circRNA的功能从传统的miRNA海绵或蛋白结合拓展到了直接调控染色质结构的新层面，建立了circRNA-染色质重塑-化疗耐药的新联系。此外，研究通过计算生物学方法筛选出的先导化合物HY-B0509，为靶向BPTF-665aa克服耐药提供了潜在的治疗策略。尽管HY-B0509的体内外药效和优化仍需进一步实验验证，但该研究无疑为理解T-LBL/ALL耐药机制和开发新的治疗方法开辟了新的方向，具有重要的理论意义和临床转化潜力。