葫芦素E通过多组学分析揭示M1巨噬细胞极化抑制机制及其在类风湿关节炎治疗中的潜力

《Journal of Orthopaedic Surgery and Research》：Cucurbitacin E inhibits M1 macrophage polarization and attenuates rheumatoid arthritis: a multi-omics analysis and experimental validation

本研究针对类风湿关节炎(RA)治疗中存在的副作用和耐药性问题，通过整合转录组学、单细胞测序和网络药理学等多组学方法，结合实验验证，系统探讨了天然化合物葫芦素E(CuE)通过调控M1巨噬细胞极化改善RA的机制。研究发现高浓度CuE(10 nM和30 nM)可显著抑制M1巨噬细胞极化，并鉴定出CCR2、NFKB1、NT5E、PIK3R1、TYRO5个关键生物标志物，构建的诊断模型AUC达0.94。该研究为RA提供了新的治疗策略和潜在靶点。

　　

在全球范围内，类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis, RA）困扰着约1%的人口，这种慢性自身免疫性疾病以关节炎症和破坏为特征，给患者的生活质量带来沉重负担。尽管现有治疗方法不断进步，但抗炎药物和生物制剂常常伴随副作用，且部分患者会出现耐药现象，这促使科学家们不断寻找更安全有效的治疗策略。

近年来，天然化合物因其多靶点作用和较低毒性备受关注。葫芦素E（Cucurbitacin E, CuE）作为一种从葫芦科植物中提取的四环三萜类化合物，已被证明具有抗炎、抗氧化和免疫调节特性，在癌症、神经退行性疾病和炎症性疾病中展现出治疗潜力。然而，CuE在RA中的作用机制尚不明确，尤其缺乏系统性的多组学分析和实验验证。

熊浩兰等研究人员在《Journal of Orthopaedic Surgery and Research》上发表的研究，首次通过整合转录组学、单细胞测序和网络药理学等多组学方法，结合实验验证，系统揭示了CuE通过抑制M1巨噬细胞极化来缓解RA的机制。研究发现RA患者滑膜组织中M1巨噬细胞浸润显著增加，通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）识别出与巨噬细胞极化相关的基因模块，并利用机器学习算法筛选出CCR2、NFKB1、NT5E、PIK3R1、TYRO5个关键生物标志物。基于这些标志物构建的诊断模型表现出极高的准确性（AUC=0.94）。伪时间轨迹分析和细胞通讯分析表明，CuE可能通过调节M1巨噬细胞的分化过程和细胞间信号网络来发挥治疗作用。流式细胞术实验证实，高浓度CuE（10 nM和30 nM）可显著抑制脂多糖（LPS）和干扰素γ（IFNγ）诱导的M1巨噬细胞极化，表现为CD80和CD86表达水平的降低。

研究采用的主要技术方法包括：从GEO数据库获取人类和小鼠滑膜组织转录组数据（GSE89408、GSE1919、GSE184609）并进行标准化处理；通过免疫浸润分析、WGCNA、机器学习（SVM-RFE和Boruta算法）筛选关键基因；利用单细胞测序数据进行细胞聚类、伪时间轨迹分析和细胞通讯分析；通过流式细胞术验证CuE对THP-1细胞来源的M1巨噬细胞极化的影响。

免疫浸润和巨噬细胞极化景观

免疫浸润分析显示，RA患者中巨噬细胞、M1巨噬细胞和M2巨噬细胞群体的数量存在显著差异。M1巨噬细胞在疾病组中的浸润明显增加，这与RA的炎症状态密切相关。

WGCNA揭示巨噬细胞相关模块

通过WGCNA分析，研究人员识别出11个基因模块，其中5个模块（MEgreen、MEmagenta、MEpurple、MEred、MEturquoise）与巨噬细胞极化密切相关。这些模块共包含9767个基因，显著富集于免疫反应和炎症通路。

基因交叉与富集分析揭示关键通路

WGCNA模块基因与CuE靶基因的交集分析确定了32个重叠基因，包括CCR2、NFKB1、PIK3R1等。富集分析显示这些基因与细胞凋亡、自噬和铁死亡等过程相关，并显著富集于PI3K-Akt和趋化因子信号通路。

生物标志物发现与交叉验证

通过SVM-RFE和Boruta两种机器学习算法，研究人员筛选出12个候选生物标志物，最终确定CCR2、NFKB1、NT5E、PIK3R1、TYRO5个在训练集和验证集中均表现出显著差异表达的关键基因。这些基因的功能相似性超过0.4，表明它们在生物学功能上具有中度相关性。

诊断模型展现高准确性

基于5个生物标志物构建的诊断列线图模型显示出卓越的预测性能，AUC值达到0.94。校准曲线和决策曲线分析（DCA）进一步证实了模型的准确性和临床实用性。

单细胞分析识别关键细胞

基于GSE184609单细胞数据集，研究人员成功注释了8种细胞类型：成纤维细胞、M1巨噬细胞、M2巨噬细胞、B细胞、中性粒细胞、T细胞、单核细胞和内皮细胞。比例分析显示M1巨噬细胞在疾病组中表达更高，因此被确定为后续分析的关键细胞。

伪时间轨迹分析

伪时间轨迹分析显示，疾病组样本分布在状态1-5，而对照组样本更多集中在状态1和5。关键基因Ccr2和Nfkb1的表达随着分化阶段的推进而降低，表明CuE可能通过调节这些基因的表达来抑制M1巨噬细胞极化。

细胞通讯分析

细胞通讯分析表明，与对照组相比，疾病组中M1巨噬细胞与成纤维细胞、M2巨噬细胞、B细胞、中性粒细胞、单核细胞和内皮细胞之间的相互作用增强，而与T细胞的相互作用减弱。这表明CuE可能通过调节这些细胞间的信号网络来缓解炎症反应。

流式细胞术分析

CCK-8实验确定CuE干预THP-1细胞的最佳条件为30 nmol/L作用24小时。流式细胞术分析显示，低浓度CuE（1 nM和3 nM）对LPS/IFNγ诱导的M1极化无显著影响，而高浓度CuE（10 nM和30 nM）显著降低CD80和CD86的表达，证实CuE可抑制M1巨噬细胞极化过程。

研究结论与讨论部分强调，巨噬细胞在RA发病机制中起着关键作用，其极化状态对疾病进展和治疗具有重要意义。本研究通过多组学分析结合实验验证，首次系统阐明了CuE通过抑制M1巨噬细胞极化来缓解RA的机制。发现的5个关键生物标志物（CCR2、NFKB1、NT5E、PIK3R1、TYROBP）不仅具有诊断价值，也为RA治疗提供了新的靶点。CuE作为天然化合物，与传统RA治疗药物相比可能具有更好的安全性和耐受性。未来研究需要进一步验证CuE在动物模型和临床试验中的治疗效果，探索其与其他RA治疗药物的联合应用，优化给药方法和剂量，推动其临床应用。该研究为RA的诊断和治疗提供了新的思路和策略，具有重要的科学意义和临床价值。