来自隐秘代谢途径的肽类精氨酸酶会在孤儿RiPP家族中尚未被研究的成员上引入鸟氨酸残基

《ChemBioChem》：Peptide Arginases from Cryptic Pathways Install Ornithine Residues in Uncharacterized Members of Orphan RiPP Families

riPP生物合成中肽基精氨酸酶FlmR和OhkR的催化方向性及结构机制研究。通过体内体外实验证实FlmR对FlmA1-3的N-到C-端方向性催化，OhkR对OhkA1-2的C-到N-端方向性催化。AlphaFold3预测显示两种酶与底物形成二聚体复合物，揭示精氨酸残基与活性位点金属簇的精确结合模式。研究为Ornithine修饰肽类药物开发提供新工具。

　　在自然界中，由核糖体合成并经过翻译后修饰的肽（RiPPs）是一类具有高度多样性和生物活性的天然产物。这些化合物因其独特的化学结构和强大的生物功能而备受关注，特别是在药物开发领域。RiPPs的生物合成通常涉及一个前体肽，该前体由核糖体合成，并通过一系列翻译后修饰酶的作用，最终形成具有生物活性的成熟肽。这些修饰酶被称为“成熟酶”或“maturases”，它们通常依赖于前体肽的N端引导区域来执行其功能。这类酶在生物合成过程中表现出对核心区域修饰的高度宽容性，使得它们成为探索新的生物合成途径和药物设计的重要工具。

近年来，一种新型的成熟酶——肽精氨酸酶（peptide arginases）引起了科学界的广泛关注。肽精氨酸酶属于一个新发现的成熟酶家族，其功能是将前体肽中的精氨酸残基转化为非蛋白质氨基酸鸟氨酸（ornithine），并释放尿素作为副产物。这种转化过程在多种天然产物的生物合成中起着关键作用，如抗病毒化合物landornamide A，其中包含两个未修饰的鸟氨酸残基。此外，鸟氨酸在非核糖体肽合成酶（NRPSs）生成的多种化合物中也常见，包括铁载体（如pyoverdine和erythrochelin）和抗生素（如bacitracin A和gramicidin S）。这些鸟氨酸残基不仅作为结构的一部分，还可能成为进一步修饰的前体，例如乙酰化、酰化、甲基化和羟基化等，从而赋予肽分子不同的生物活性。

肽精氨酸酶家族的成员，如OspR，最初在2020年被鉴定出来，它在蓝藻Kamptonema sp. PCC 6506（原Oscillatoria）中参与landornamide A的生物合成。随着研究的深入，科学家们发现这一家族的成员不仅与已知的前体肽类型（如NHLP和N11P）相关，还与一些尚未被表征的前体肽类型有关，例如SCIFF和三个基于保守序列基序的“孤儿”前体类型：“SCCRRSCN”、“DD(I/V)LF”和“MGXRRSSE”。目前已知的七种肽精氨酸酶可以作用于四种不同的前体类型，其中OspR因其对前体中精氨酸位置和数量的高度耐受性而被认为是该家族中最通用的成员。OspR不仅在天然产物的合成中发挥重要作用，还在肽工程中被用于生成针对Bacillus subtilis具有抗菌活性的lacticin 481类似物，以及优化GLP-1受体激动剂semaglutide的变体，用于治疗2型糖尿病和肥胖。

在本研究中，科学家们发现了一种新的肽精氨酸酶——FlmR和OhkR，它们与一种尚未被表征的前体类型“DD(I/V)LF”相关。这种前体类型属于一个“孤儿”RiPP家族，意味着其生物合成机制尚未完全理解。为了研究这些酶的功能，研究人员在大肠杆菌中进行了体内和体外的共表达实验，以验证它们对不同前体肽的修饰能力。实验结果显示，FlmR和OhkR能够将前体中的精氨酸残基转化为鸟氨酸，并且在某些情况下表现出特定的方向性。例如，FlmR在处理FlmA3时，其修饰方向是从C端向N端进行，而OhkR在处理OhkA1和OhkA2时也表现出类似的模式。此外，研究还发现，FlmR和OhkR对某些非天然前体也具有一定的交叉反应能力，表明它们在肽修饰领域具有广泛的应用潜力。

为了进一步了解这些酶的结构和作用机制，研究团队利用AlphaFold 3对FlmR和OhkR的结构进行了预测。AlphaFold 3是一种强大的蛋白质结构预测工具，能够基于氨基酸序列生成高精度的三维模型。通过结构分析，研究人员发现FlmR和OhkR的结构与已知的OspR高度相似，均具有三重保守序列基序（DXHD、EEH(N/H)EAF和LDIDLYFSC），这些基序对于酶的活性至关重要。同时，这些酶形成同源二聚体的结构特征也与传统精氨酸酶不同，后者通常形成三聚体或六聚体。这一结构特征可能有助于酶与较长的肽底物结合，并通过特定的结合区域实现对前体的识别和修饰。

结构模型的分析还揭示了这些酶如何识别和结合其前体底物。例如，在FlmR与FlmA1的结合模型中，R43（FlmA1的C端精氨酸）被预测为与活性位点的多个残基相互作用，包括H14、D41、D45、D166和D168。这一发现与实验数据一致，表明FlmR在处理FlmA1时优先修饰C端的精氨酸残基。类似地，在OhkR与OhkA1的结合模型中，R45（OhkA1的C端精氨酸）也被预测为与活性位点的多个残基相互作用，进一步支持了OhkR对C端精氨酸的优先修饰。此外，研究还发现，某些前体中的精氨酸残基可能被优先修饰，而其他残基则可能处于不同的位置或不被修饰，这取决于前体的结构和酶的特异性。

为了验证这些酶对不同前体的修饰能力，研究团队还进行了体外动力学分析。结果显示，FlmR对FlmA1的Km值为7.8 μM，kcat值为8.7 × 10?? s?1，而OhkR对OhkA1的Km值为2.3 μM，kcat值为10.3 × 10?? s?1。这些数据表明，FlmR和OhkR在催化效率上相对较低，这与它们在特殊代谢中的作用相符。相比之下，传统的精氨酸酶（如人类精氨酸酶-1）具有更高的催化效率（kcat值为300 s?1），但对底物的亲和力较低（Km值为2.3 mM）。这种差异可能反映了肽精氨酸酶与传统精氨酸酶在底物识别和催化机制上的不同。

研究还发现，某些前体肽中的精氨酸残基可能被优先修饰，而其他残基则可能处于不同的位置或不被修饰，这取决于前体的结构和酶的特异性。例如，在FlmA3的处理中，实验数据表明C端的R46被优先修饰，而N端的R43未被修饰。这可能意味着，这些酶在修饰过程中存在一定的方向性，而这种方向性可能与前体中的某些结构特征相关。同样，在OhkA1和OhkA2的处理中，实验数据支持OhkR对C端精氨酸的优先修饰，这与结构预测结果一致。

为了进一步探索这些酶与前体之间的相互作用，研究团队还利用AlphaFold 3预测了单个修饰前体与酶的结合情况。例如，在FlmA1-R34K模型中，R43（FlmA1的C端精氨酸）仍然被预测为与活性位点相互作用，而R34（FlmA1的N端精氨酸）则被预测为与活性位点结合，这与FlmR在处理FlmA1时的修饰顺序一致。类似地，在OhkA1-R43K模型中，R45（OhkA1的C端精氨酸）被预测为与活性位点相互作用，而R43（OhkA1的N端精氨酸）则被预测为与活性位点结合。这些预测结果不仅与实验数据吻合，还为理解这些酶如何识别和修饰其底物提供了重要的线索。

此外，研究还发现，某些前体中的保守基序（如“DD(I/V)LF”）可能在酶的识别过程中起关键作用。例如，在FlmA1和FlmA3的处理中，该基序的每个残基都被预测为与FlmR的活性位点相互作用，而在FlmA2中，只有基序中的部分残基（I53、L54和F55）与FlmR相互作用。这表明，不同的前体可能具有不同的识别机制，这取决于其结构和基序的组成。类似地，在OhkA1和OhkA2的处理中，基序中的大多数残基（除了D65在OhkA2中）与OhkR相互作用，进一步支持了这些基序在酶识别中的重要性。

研究还发现，前体的N端区域可能并不直接参与酶的识别过程。为了验证这一假设，研究人员删除了OhkA1和OhkA2的N端区域，并与OhkR进行了共表达实验。结果显示，这些修饰后的前体肽仍然能够被OhkR修饰，说明N端区域在酶的识别过程中并不是必需的。这一发现为理解这些酶如何识别和结合其底物提供了新的视角，并为进一步探索其作用机制奠定了基础。

总体而言，本研究通过体内和体外实验，结合结构预测和动力学分析，揭示了FlmR和OhkR这两种新的肽精氨酸酶在生物合成中的功能及其与前体肽的相互作用机制。这些酶能够将特定的精氨酸残基转化为鸟氨酸，并且在某些情况下表现出特定的方向性。此外，研究还发现，这些酶对不同的前体肽具有一定的交叉反应能力，表明它们在肽修饰领域具有广泛的应用潜力。这些发现不仅有助于理解RiPPs的生物合成机制，还为开发基于肽的药物提供了新的思路和工具。