鞣花酸及其纳米颗粒通过靶向表皮生长因子受体来提高低密度脂蛋白受体的水平，从而缓解动脉粥样硬化

《FASEB BioAdvances》：Ellagic Acid and Its Nanoparticles Mitigate Atherosclerosis by Elevating Low-Density Lipoprotein Receptor Levels Through Targeting of the Epidermal Growth Factor Receptor

动脉粥样硬化是一种慢性血管疾病，由胆固醇在血管内膜沉积引起。本研究发现天然多酚 ellagic acid（EA）通过直接结合EGFR的胞外域（Kd=4.33×10?? M，结合能-7.1 kcal/mol），激活EGFR-MAPK信号通路，稳定低密度脂蛋白受体（LDLR）mRNA并上调其蛋白表达，从而促进胆固醇代谢。为解决EA水溶性差（<10 μg/mL）、生物利用度低（<0.06%）及肠道菌群代谢为尿石灵衍生物的问题，采用人血清白蛋白（HSA）自组装法制备EA-NPs（粒径218.5 nm，zeta电位-26.4 mV）。体内实验证实EA-NPs可显著减少ApoE?/?小鼠高脂饮食诱导的动脉斑块面积（降低38.7%±5.2%），同时改善肝脂沉积和血清胆固醇水平（TC降低21.3%±3.8%，p<0.05）。机制研究表明，EA-NPs通过EGFR磷酸化（p-EGFR升高2.1倍）和ERK磷酸化（p-ERK升高1.8倍）增强LDLR表达，且与未负载纳米颗粒相比，载药率提升至92.7%±3.1%。该研究为开发基于EA的纳米药物递送系统提供了理论依据。

　　动脉粥样硬化是一种慢性血管疾病，其特征在于大中型动脉内膜中胆固醇丰富的脂质积累。这种疾病是全球范围内发病率高、致死率高的主要疾病之一，是大多数心肌梗死和中风的诱因。因此，动脉粥样硬化的研究对于改善心血管健康具有重要意义。本研究聚焦于一种天然的多酚类化合物——没食子酸（Ellagic acid, EA），并探讨其在调节胆固醇代谢和抑制动脉粥样硬化方面的潜力。

没食子酸广泛存在于各种浆果（如石榴、蓝莓、葡萄、草莓）和茶叶中，具有多种生物活性，包括肝脏保护、血脂调节以及改善心血管疾病等。这些特性使其在生物医学领域展现出巨大的应用前景。然而，尽管EA具有良好的药理活性，其在临床应用中仍面临诸多挑战。例如，EA的水溶性较低（<10 μg/mL），生物利用度极低（<0.06%），血药浓度也受到限制（0.1–0.4 μmol/L）。在体内，未被吸收的EA主要通过肠道微生物代谢为尿石素（如尿石素A、B、C、D）以及少量的尿石素M5和M6，这些代谢产物显著削弱了EA的药理效果。因此，开发一种能够有效提高EA体内稳定性和生物利用度的给药系统成为研究重点。

本研究提出了一种基于人血清白蛋白（HSA）的纳米载体系统——EA-载人血清白蛋白纳米颗粒（EA-NPs）。HSA是一种天然的蛋白质，由585个氨基酸组成，具有17个二硫键和一个游离的半胱氨酸残基。其三级结构由三个同源结构域（I、II、III）组成，通过二硫键连接，每个结构域又包含两个亚结构域（A和B）。HSA的两个主要药物结合位点位于亚结构域IIA和IIIA，能够结合疏水性药物并提高其生物利用度。HSA在血浆中含量丰富，具有良好的生物相容性、生物降解性和非免疫原性，因此是疏水药物的理想载体。

在本研究中，EA-NPs通过自组装方法制备。首先，将HSA溶解于Tris缓冲液中，随后加入DTT以促进二硫键的还原，帮助EA与HSA结合。接着，将EA溶解于二甲基亚砜（DMSO）中加入到HSA溶液中，持续搅拌并使用低功率超声波分散聚集的颗粒。最后，通过透析去除未结合的EA和残留的DTT。通过这种方法，EA被有效包裹，形成稳定的纳米颗粒，从而改善其在体内的稳定性与生物利用度。

为了进一步验证EA-NPs的特性，我们对其形态、粒径、分散指数和Zeta电位进行了分析。透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）的结果显示，EA-NPs呈现球形结构，与自由EA的杆状结构形成鲜明对比。粒径分析表明，EA-NPs的平均直径为218.5 nm，分散指数（PDI）为0.342，Zeta电位为?26.4 mV，表明其具有良好的分散性和稳定性，适合体内应用。此外，体外释放实验显示，EA-NPs在2小时内有约37%的快速释放，随后呈现持续释放特性，这有助于其在体内的药物释放效率。

在细胞实验中，我们使用HepG2细胞研究EA对低密度脂蛋白受体（LDLR）表达的影响。MTT实验表明，EA在不同浓度下均未对HepG2细胞的活力产生显著影响，说明其具有良好的细胞相容性。Western blot分析显示，EA显著提高了LDLR蛋白的表达水平，并通过促进低密度脂蛋白（LDL）的摄取，进一步验证了其在细胞膜上的功能增强。此外，我们还发现，EA能够激活表皮生长因子受体（EGFR）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路，从而促进LDLR的表达。为了确认EGFR是EA调控LDLR表达的关键靶点，我们使用了EGFR阻断抗体Cetuximab，结果表明其能够抑制EA诱导的LDLR表达增加，进一步支持EGFR在这一过程中的核心作用。

为了评估EA-NPs在体内的抗动脉粥样硬化效果，我们使用了ApoE?/?小鼠模型进行实验。结果显示，EA-NPs能够显著降低肝脏脂质积累，减少主动脉斑块形成，并改善血脂水平。具体而言，EA-NPs显著降低了总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的水平，而对甘油三酯（TG）没有显著影响。这表明EA-NPs在调节血脂方面具有针对性，能够有效改善动脉粥样硬化相关的病理指标。

在组织学分析中，我们使用苏木精-伊红（H&E）染色和弹性染色（EVG）评估动脉粥样硬化病变的组织学变化。结果显示，EA-NPs显著减少了HFD喂养ApoE?/?小鼠主动脉根部的坏死区域，并增加了弹性纤维的含量，这表明其能够改善血管结构，减少动脉粥样硬化的进展。此外，免疫荧光分析显示，EA-NPs显著降低了巨噬细胞标志物CD68和血管平滑肌细胞标志物αSMA的表达，进一步证明其在抑制炎症和细胞迁移方面的效果。

从分子机制角度来看，EA通过与EGFR的胞外结构域结合，激活EGFR-ERK信号通路，从而提高LDLR的表达。分子对接实验表明，EA与EGFR的结合涉及氢键和疏水相互作用，这些相互作用对于维持EA-EGFR复合物的稳定性至关重要。此外，通过表面等离子共振（SPR）分析，我们测定了EA与EGFR结合的解离常数（Kd）为4.33×10?7 M，结合能为?7.1 kcal/mol，进一步支持EA与EGFR的特异性结合。

研究还揭示了EA在调控LDLR表达中的作用机制。通过qPCR分析，我们发现EA能够显著提高LDLR的mRNA水平，并通过促进其mRNA稳定性来增强LDLR蛋白的表达。这一机制可能与ERK信号通路的激活有关，因为ERK在调控LDLR表达方面发挥着重要作用。此外，EA-NPs在体内同样能够激活EGFR-ERK通路，并提高LDLR的表达水平，这与体外实验结果一致，表明其在不同实验模型中具有良好的一致性和有效性。

尽管EA-NPs在体内外均表现出良好的抗动脉粥样硬化效果，但其临床转化仍面临一定挑战。目前，EA-NPs的给药方式仍需依赖静脉注射，这在实际应用中可能带来一定的操作复杂性和成本问题。因此，未来的研究应进一步探索EA的口服给药方式，并评估其在肠道微生物代谢后形成的尿石素衍生物的药理作用。通过比较口服EA及其代谢产物与静脉注射EA-NPs的疗效，可以更全面地了解其在临床应用中的潜力，并为开发更高效的药物递送系统提供依据。

综上所述，本研究揭示了EA通过激活EGFR-ERK信号通路，提高LDLR表达水平，从而有效抑制动脉粥样硬化的发生和发展。EA-NPs作为一种新型的药物递送系统，不仅克服了EA的水溶性差和生物利用度低的问题，还通过体内实验验证了其在改善血脂水平和减少动脉粥样硬化病变方面的潜力。这些发现为开发基于EA的抗动脉粥样硬化策略提供了坚实的理论基础，并为未来的研究方向和临床应用提供了新的思路。