基于CRISPR/Cas13a系统的高灵敏度炭疽菌检测技术

《Microbial Biotechnology》：Highly Sensitive Field Detection Technology for Anthrax Based on the CRISPR/Cas13a System

本研究开发了基于CRISPR/Cas13a的高灵敏度现场检测技术，结合MIRA扩增和双crRNA设计，检测限达250 copies/mL，并通过冻干技术实现便携式设备，为炭疽杆菌等新发传染病的快速诊断提供新方案。

　　在当前全球公共卫生体系中，快速、准确、便携的病原体检测技术对于应对突发传染病和生物安全威胁至关重要。本文介绍了一种基于CRISPR/Cas13a系统的高灵敏度现场检测技术，用于识别炭疽芽孢杆菌（*Bacillus anthracis*）的毒力基因CYA。该技术不仅在实验室环境中表现出色，还特别适用于野外和资源有限的现场检测需求。通过结合多重酶等温快速扩增（MIRA）技术与CRISPR/Cas13a检测系统，研究团队开发出了一种新型的检测平台，能够在短时间内完成样本的检测，并且无需依赖复杂的实验室设备。这一成果为现场病原体快速诊断提供了新的解决方案。

炭疽是一种由炭疽芽孢杆菌引起的动物源性传染病，其病原体能够以芽孢形式在土壤中长期存活。该病原体的传播与环境条件、地理因素及畜牧业活动密切相关。在某些地区，如欧亚大陆的干旱和温带区域，炭疽的发病率较高。因此，对炭疽芽孢杆菌的快速检测能力对于及时防控疾病传播具有重要意义。传统的病原体检测方法，如定量实时聚合酶链式反应（qPCR），虽然在实验室中被广泛使用，但在现场检测中存在诸多限制。例如，qPCR需要较长的样本前处理时间，且依赖大型仪器，这在野外或缺乏专业设备的地区可能并不适用。

为了克服这些挑战，研究团队引入了CRISPR/Cas13a系统，这是一种近年来在基因编辑和病原体检测领域备受关注的新技术。CRISPR/Cas13a系统利用RNA引导的Cas13a蛋白，能够识别特定的RNA序列并引发非特异性切割反应。这一机制使得CRISPR/Cas13a在病原体检测中表现出高灵敏度和特异性。然而，现有的CRISPR/Cas12系统在结合等温扩增技术时，往往需要更长的检测时间或复杂的操作流程，限制了其在野外环境中的应用。本文的研究重点在于开发一种能够在现场快速、准确检测炭疽芽孢杆菌的便携平台。

为了提高检测灵敏度，研究团队采用了一种双crRNA（CRISPR RNA）策略。crRNA是CRISPR系统中用于识别目标RNA序列的关键组件。通过筛选和优化crRNA的序列以及MIRA扩增引物，研究团队成功构建了一种能够实现单拷贝检测的CRISPR/Cas13a系统。实验结果显示，该系统在1000拷贝/毫升的浓度下能够检测到炭疽芽孢杆菌，而在500拷贝/毫升的浓度下也能检测到信号，但其稳定性相对较低。这一结果表明，双crRNA策略显著提高了系统的灵敏度，为现场检测提供了更高的准确性。

此外，研究团队还对检测系统的特异性进行了评估。他们使用了多种常见呼吸道病原体的样本，包括流感嗜血杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和短小芽孢杆菌，以验证该系统是否能够区分炭疽芽孢杆菌与其他病原体。实验结果表明，该系统对炭疽芽孢杆菌的检测信号明显高于其他病原体，说明其具有良好的特异性。这一特性对于在复杂环境中快速准确识别炭疽芽孢杆菌至关重要。

在实际应用方面，研究团队设计了一种便携式的现场检测设备，并结合了冻干技术，使得检测试剂能够在常温下长期保存。这种设计不仅减少了对冷链运输的依赖，还提高了检测的便利性和适用性。通过将MIRA扩增试剂和CRISPR检测试剂分别冻干并封装在微芯片中，设备能够在按下按钮后迅速启动检测流程，并在30分钟内完成检测。检测结果通过指示灯显示，用户可以直观地判断样本是否为阳性或阴性。实验显示，所有20个阳性样本均被正确识别，而13个阴性样本也被无误分类。这一结果表明，该检测设备在临床模拟样本中具有良好的检测性能。

为了进一步验证检测系统的定量能力，研究团队还进行了浓度梯度实验。他们将炭疽芽孢杆菌的CYA基因质粒稀释到不同的浓度，并利用CRISPR/Cas13a系统和qPCR方法进行检测。结果表明，CRISPR检测方法与qPCR方法在浓度与信号强度之间存在显著的线性关系，相关系数高达0.9784。这一结果表明，CRISPR/Cas13a系统不仅具有高灵敏度，还具备良好的定量能力，能够用于病原体的定量分析。

在冻干技术的开发过程中，研究团队优化了冻干试剂的配方，包括使用5%的甘露醇、5%的蔗糖、2.5%的 pullulan 和 0.1 M 的HEPES。这些成分有助于维持试剂的活性，并提高其在常温下的稳定性。实验结果显示，冻干试剂在荧光信号强度上与液态试剂非常接近，但在长期储存性能方面仍需进一步验证。相比之下，现场冻干试剂的活性略低于液态系统，因此未来的研究将考虑将冻干试剂的制备外包给第三方公司，以提高其质量和稳定性。

研究团队还开发了一种便携式的CRISPR现场检测技术，该技术结合了MIRA等温扩增和CRISPR/Cas13a检测，能够在不依赖实验室设备的情况下完成检测。设备的操作流程相对简单，用户只需将提取的核酸样本加入芯片的“大入口”，然后按下按钮，样本就会被推入反应腔，与冻干试剂发生反应。随后，设备通过光学传感器读取荧光信号，并将结果以指示灯的形式显示。阳性样本的指示灯会变为红色，而阴性样本则显示为绿色。这一设计不仅提高了检测的可视化程度，还减少了人为判断的误差。

在实际应用中，该检测设备能够处理从高浓度到低浓度的样本，并且在30分钟内完成检测。研究团队对29个临床模拟样本进行了测试，结果显示所有样本的检测结果均与qPCR方法一致，表明该设备在实际应用中具有良好的可靠性。此外，该设备的检测限为250拷贝/毫升，显著低于传统荧光检测方法的1000拷贝/毫升，这使得其在低浓度样本的检测中更具优势。这种高灵敏度的检测能力对于早期发现病原体、防止疫情扩散具有重要意义。

研究团队还探讨了该技术在应对新兴传染病中的潜在应用。由于CRISPR/Cas13a系统具有高度的可定制性，只需更换不同的crRNA和引物，就可以快速调整系统以检测其他病原体。这一特性使得该技术不仅适用于炭疽芽孢杆菌的检测，还具有广泛的应用前景。例如，该技术可以用于检测其他高危病原体，如新冠病毒（SARS-CoV-2）等，从而为现场快速诊断提供支持。

然而，尽管该技术在许多方面表现出色，但仍存在一些局限性。目前，该设备只能检测单一病原体，无法实现多病原体的同步检测。在复杂环境中，多病原体的检测需求可能更高，因此未来的研究需要进一步探索能够同时检测多种病原体的检测设备。此外，该设备仍然需要操作人员手动提取核酸，这在某些情况下可能增加操作的复杂性。因此，研究团队计划开发一种便携式核酸提取设备，使得检测流程更加自动化，从而提高设备的使用便捷性。

总体而言，本文提出了一种基于CRISPR/Cas13a系统的高灵敏度、便携式的现场检测技术，能够快速、准确地识别炭疽芽孢杆菌的CYA基因。该技术不仅在实验室中表现出良好的性能，还特别适用于野外和资源有限的环境。通过结合等温扩增和冻干技术，研究团队成功构建了一种无需复杂设备即可完成检测的平台，为现场病原体检测提供了新的可能性。此外，该技术在定量分析方面也表现出色，能够与qPCR方法相媲美，具有重要的应用价值。

未来，研究团队将继续优化该技术，使其能够同时检测多种病原体，并进一步提高其自动化程度。此外，他们还计划开发更加经济实惠的设备，以降低检测成本，提高其在公共卫生领域的可及性。通过不断改进和创新，这种基于CRISPR/Cas13a的现场检测技术有望成为应对突发传染病和生物安全威胁的重要工具，为全球公共卫生体系提供强有力的技术支持。