三聚丙啶单叠氮化物（PMA）qPCR检测方法能够快速区分活的猪繁殖与呼吸综合征病毒

《Transboundary and Emerging Diseases》：A Triplex Propidium Monoazide (PMA) qPCR Assay Enables Rapid Discrimination of Live Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Viruses

蓝耳病病毒（PRRSV）检测新方法：开发三重PMA-qPCR技术区分中国流行毒株

　　猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, PRRSV）引起的一种严重危害全球养猪业的传染病。该疾病每年给全球的养猪业带来高达27亿美元的经济损失，尤其在中国，由于病毒的高遗传多样性，不同毒株的流行给防控工作带来了极大的挑战。目前，尽管分子生物学检测方法如PCR和qPCR被广泛用于PRRSV的检测，但这些方法无法区分病毒是否具有感染性。因此，开发一种能够有效区分活病毒与灭活病毒的检测技术显得尤为重要。

为了应对这一问题，研究团队开发了一种三重PMA-qPCR检测方法，用于快速识别在中国流行的三种主要PRRSV毒株：NADC34-like PRRSV-2、NADC30-like PRRSV-2以及高致病性PRRSV-2（HP-PRRSV-2）。该方法结合了PMA（碘化丙啶单甲基）和qPCR技术，通过PMA对灭活病毒进行标记，从而在PCR扩增过程中区分出具有感染性的病毒。PMA是一种光敏性染料，它无法穿透活病毒的包膜，因此不会对病毒核酸造成影响，而灭活病毒的包膜破裂后，PMA会在光照条件下与病毒核酸共价结合，阻止其在PCR中的扩增。这种方法不仅能够提高检测的准确性，还能为病毒的防控提供科学依据。

在实验设计中，研究者首先比较了多种病毒灭活方法，包括紫外线、高温以及三种不同的消毒剂，最终确定了100°C处理1.5分钟为最有效的灭活策略。随后，通过优化PMA的浓度、结合温度、结合时间和光照时间，进一步提高了检测的灵敏度和特异性。研究结果显示，PMA处理后的病毒核酸在qPCR中表现出显著的抑制效应，而活病毒的核酸则能被有效扩增，从而实现了对活病毒的准确识别。

在临床应用方面，研究团队对452份临床样本进行了检测，这些样本包括环境粪便、肺组织、淋巴结和血清等，来自中国七个省份。结果显示，三重qPCR检测共发现了83份PRRSV阳性样本，其中NADC34-like、NADC30-like和HP-PRRSV-2分别有25、48和15份阳性样本。而三重PMA-qPCR检测仅识别出65份阳性样本，其中NADC34-like、NADC30-like和HP-PRRSV-2分别有21、36和9份阳性样本。值得注意的是，所有通过qPCR检测为阳性的样本中，有18份无法通过PMA-qPCR检测出病毒核酸，这表明这些样本中的病毒可能已经灭活，无法进行进一步的分离培养。相比之下，PMA-qPCR检测为阳性的样本中，均能够成功分离出病毒，进一步验证了该方法的有效性。

此外，研究还分析了不同毒株在各省份的分布情况。结果显示，NADC34-like PRRSV-2主要分布在山东、江苏和河南等地，而NADC30-like PRRSV-2则广泛存在于多个省份，HP-PRRSV-2则在福建等地更为常见。这一发现有助于了解不同地区PRRSV的流行趋势，为制定针对性的防控措施提供了依据。

三重PMA-qPCR方法不仅具有较高的特异性和灵敏度，还具备良好的重复性和可操作性。该方法能够在短时间内完成检测，适用于大规模的环境监测和临床筛查。与传统的病毒分离方法相比，PMA-qPCR具有更高的效率，能够减少实验室操作的时间和成本，同时避免因非感染性病毒导致的假阳性结果。这种方法在实验室环境中可以用于快速筛查感染性样本，同时也可以用于疫苗质量的评估，以确保疫苗的安全性和有效性。

尽管三重PMA-qPCR方法在检测活病毒方面表现出色，但它仍然存在一些局限性。例如，该方法仅适用于NADC34-like、NADC30-like和HP-PRRSV-2三种毒株，无法检测PRRSV-1和经典PRRSV-2毒株。因此，在实际应用中，可能需要结合其他通用检测方法，以实现对所有PRRSV毒株的全面监测。此外，某些灭活方法如紫外线和漂白剂可能会影响PMA-qPCR的检测效果，因此在实际操作中需要选择合适的灭活条件，以确保检测结果的准确性。

综上所述，这项研究首次报道了一种三重PMA-qPCR方法，用于快速识别在中国流行的三种主要PRRSV毒株。该方法不仅能够有效区分活病毒与灭活病毒，还具备良好的灵敏度和特异性，适用于环境样本和临床样本的检测。此外，该方法在疫苗质量评估和大规模疫情监测中具有重要应用价值，为PRRS的防控提供了新的技术手段。未来的研究可以进一步优化该方法，扩大其适用范围，并探索其在其他病毒检测中的应用潜力。