远程数字图像读片在真菌诊断中的有效性及影响评估：一项提升诊断可及性的创新研究

《Mycopathologia》：Assessing the Validity and Impact of Remote Digital Image Reading in Fungal Diagnostics

本研究针对全球真菌感染诊断能力不足、尤其资源匮乏地区缺乏专业真菌学家的问题，开展了远程数字图像读片在真菌诊断中的可行性研究。通过对474张酵母、丝状真菌及临床样本直接荧光显微镜图像的分析，发现远程诊断准确率达78-93%，证实了telemycology可作为传统显微镜诊断的有效替代方案，对提升LMICs真菌感染诊断能力具有重要意义。

　　

在全球范围内，侵袭性真菌感染(IFI)正成为日益严重的公共卫生威胁，特别是对HIV感染者、白血病患者和器官移植受体等免疫缺陷人群。然而，与细菌学诊断相比，真菌学诊断能力明显滞后，许多地区特别是中低收入国家(LMICs)缺乏专业的真菌学家和诊断设施。最近的一项调查显示，非洲164个机构中仅有5个达到欧洲医学真菌学联盟(ECMM)蓝色状态真菌中心的最低实验室要求。这种诊断能力的不足导致侵袭性真菌感染诊断不足和治疗延迟，最终影响患者预后。

传统真菌诊断依赖临床样本的直接显微镜检查和培养技术，需要经验丰富的专业人员。考虑到临床真菌学培训极具挑战性，且大多数中心难以招募全天候工作的医学专业人员，标准化远程数字图像读片可能使不同时区的专家能够向偏远合作实验室提供远程诊断支持。因此，实施全球范围的远程诊断网络可能使任何实验室的专家能够为专业知识和资源有限的地区提供全天候服务，从而实现真菌感染的及时准确诊断并立即开始有效治疗。

虽然自动化和数字技术在临床微生物学的细菌诊断中已经产生了变革性影响，但在临床真菌学中却很少实施。现代进展包括自动平板接种、孵育和数字平板读片，提高了工作流程效率并缩短了细菌感染的诊断时间。这些工具同样有潜力革新真菌诊断，提供更快速、更准确的鉴定方法。尽管人工智能(AI)，特别是深度学习和卷积神经网络，已经在其他医学领域增强了图像分析，并显示出在真菌诊断中应用的前景，但这些系统仍在开发中，需要时间才能出现一个普遍可及且经过验证的系统。

相比之下，目前已有工具可以收集高质量图像并与不同地理区域的专家共享。然而，关于远程数字分析在临床真菌学中的性能尚无信息。本研究旨在开发和验证用于真菌诊断的远程数字图像读片。

为了评估临床真菌学样本远程数字读片的可行性，研究人员建立了一个真菌样本宏观和微观图像库。所有样本均分离自卡罗林斯卡大学实验室微生物科的临床样本。研究人员通过标准形态学特征检查、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)和凝集试验作为参考技术进行物种鉴定。

研究配置的数字图像分为三组：临床样本的直接荧光显微镜图像；丝状真菌(菌落的宏观和光学显微镜图像)；酵母(菌落的宏观图像)。直接荧光显微镜使用0.04% Blankophor? within 2% NaOH染色的样本材料，使用10倍、20倍和40倍物镜捕获图像。丝状真菌的光学显微镜使用 Scotch胶带制备物，用0.1%亚甲蓝乳酸酸蓝染色，使用20倍和40倍物镜拍摄。菌落的宏观图像使用富士数码相机在标准化条件下拍摄，酵母使用黑白两种背景，丝状真菌使用黑色背景以增强对比度。

五名具有2至35年真菌诊断经验的卡罗林斯卡大学实验室工作人员参与了数字图像的盲法读片测试。对于直接显微镜检查，参与者从酵母、丝状真菌、人工产物/非真菌结构和无法决定四个选项中选择。对于宏观酵母图像，参与者根据CHROMagar制造商建议记录菌落颜色。对于丝状真菌，要求进行物种水平或(如不可能)属水平鉴定。

研究结果显示，参与者分析的图像库总共包含474张图像，分为酵母(73张)、丝状真菌(341张)和直接显微镜检查(60张)三组。盲法读片实验分析显示，图像组对判读成功率有显著主效应。所有参与者的正确判定率对酵母和直接显微镜检查显著高于丝状真菌。酵母鉴定的最高符合率达到93%，直接显微镜检查为86%，丝状真菌为78%。

个体参与者的表现也存在显著差异，参与者3的正确判定率显著高于参与者1和5。然而，图像组和参与者之间没有显著的交互效应。具体而言，参与者1在所有三种样本类型中的成功率相似但较低，而参与者5在直接显微镜检查和酵母方面成功率较高，但在丝状真菌方面非常低。其他参与者在各图像组间表现高度一致。

在直接显微镜检查方面，参与者需要从酵母、丝状真菌、人工产物/非真菌结构和无法决定四个选项中选择。分析显示，正确判定率为86%，表明远程数字读片在初步筛查临床样本中存在真菌元素方面具有较高准确性。

在丝状真菌鉴定方面，正确判定率为78%，显著低于其他两组。研究人员分析，这可能与每样本图像数量有限或数字方法不允许用户滚动图像有关。对丝状真菌的直接真菌学诊断，识别关键特征如双叉分支和隔膜形成至关重要，但仅凭二维图像具有挑战性。评估图像深度的这种限制可能解释了丝状真菌鉴定得分较低的原因。

在酵母鉴定方面，使用显色培养基达到了93%的最高符合率。虽然显色培养基主要提供初步鉴定，但它们对于选择有效的抗真菌治疗至关重要，可以显著影响死亡率。此外，一些显色培养基现在可以提供对新兴病原体耳念珠菌(C. auris)的快速初步鉴定。

本研究探索了远程数字图像读片在临床真菌学中应用的可行性。参与人员独立分析了包括酵母、丝状真菌和临床样本直接显微镜图像在内的多样化数字图像集。研究得出结论，远程数字诊断有潜力增强真菌诊断实践，特别是在缺乏熟练真菌学家的地区，通过远程提供及时准确的诊断支持。

数字远程读片方法与标准真菌学诊断技术的总体符合率达到78-93%。按图像组分析显示，丝状真菌的鉴定准确性显著低于酵母和直接显微镜检查。丝状真菌评估准确性较低的根本原因尚不清楚。可能是每样本图像数量有限或当前研究的数字方法限制用户滚动图像，而不像手动显微镜检查那样，可能起到一定作用。

本研究涉及具有不同教育和经验背景的参与者，这可能影响了他们整体正确判定表现的差异。除了一个参与者的丝状真菌评估得分外，所有参与者的得分均超过74%。本研究中获得的结果令人鼓舞，表明本方法可用于日常临床实践。此外，存储这些图像库并将其用作远程真菌学教育和培训模块，可能代表培训的新方法，特别是考虑到当今真菌学知识传递主要依赖于现场的微观和宏观评估。

本研究中，使用显色培养基进行酵母鉴定的符合率最高(93%)。虽然显色培养基主要提供初步鉴定，但它们对于选择有效的抗真菌治疗至关重要，可以显著影响死亡率。此外，一些显色培养基现在可以提供对新兴病原体耳念珠菌的快速初步鉴定，这正成为全球关注的问题。

在解决人员教育和协调挑战方面，机器学习和人工智能的整合日益成为医学诊断中的宝贵工具，有助于简化流程和提高诊断准确性。基于人工智能的医学诊断最近已在放射学和病理学启动和实施，在这些领域显示出准确性和时间缩短方面的有希望结果。虽然临床微生物学实验室中的自动实验室接种和培养系统如今更常见，但数字读片和基于人工智能的诊断工具的实施有限。

本研究存在若干局限性。包括的分离株数量和多样性有限。然而，本研究中分析的物种涵盖了日常真菌学实践中遇到的常见病原体。计算机使用能力可能影响了每个参与者的成功率。本研究仅在一个中心进行。为解决这个问题，正在设计一个涉及来自不同国家不同机构的多中心研究。最后，本研究使用回顾性收集的样本，未评估远程数字诊断对实时临床实践的临床疗效或影响。需要纳入实时读片和临床结果数据的更广泛研究来证明远程数字读片对疾病结局的可能影响。

本研究具有若干优势。首先，它是临床真菌学领域首个比较评估远程数字读片与传统方法兼容性的研究。此外，本研究涉及的参与者选自不同的教育和经验背景，有助于有意义的多样性。本研究的另一个优势是它包括临床代表性的多种微生物和临床样本，从而涵盖了许多在临床真菌学中使用直接显微镜检查的领域。

本研究展示了远程数字读片在临床真菌学中的潜在应用。目前的结果表明，远程数字读片产生的结果与常规方法相当。然而，不同样本类型诊断准确性的结果变异性强调需要进一步改进这些技术。需要未来的多中心研究来表明该方法有可能用于远程实验室之间的协作。