通过白蛋白修饰的纳米结构脂质载体优化微小RNA的递送

《International Journal of Pharmaceutics: X》：Optimizing microRNA delivery via albumin-decorated nanostructured lipid carriers

开发阳离子纳米结构脂质载体（cNLCs）作为miRNA-27a的非病毒递送系统，但发现生物体液中的蛋白质外壳形成显著降低细胞摄取效率。为此，通过静电作用将人血清白蛋白（HSA）涂覆在miRNA/cNLC复合物表面形成albuplexes，优化了颗粒尺寸、表面电荷及稳定性，并验证其在3T3-L1细胞中的高效递送及抗脂肪生成效果。

　　在现代生物医学研究中，微小核糖核酸（microRNA, miRNA）作为基因调控的天然分子，因其在调控基因表达中的潜力而备受关注。miRNA在调控细胞功能方面发挥重要作用，尤其是在代谢性疾病如肥胖的治疗中。然而，miRNA在临床应用中面临一些关键挑战，包括其在生物环境中容易被酶降解，以及由于其亲水性和负电荷特性导致的膜渗透性差。这些限制使得miRNA在体外和体内均难以有效传递，因此开发有效的递送系统成为研究的重点。

针对这些问题，研究人员提出了利用阳离子纳米结构脂质载体（cationic nanostructured lipid carriers, cNLCs）进行miRNA递送的策略。cNLCs作为非病毒载体，能够通过静电相互作用将miRNA封装或吸附在纳米颗粒表面，从而提高其在细胞内的摄取效率。然而，在实际生物环境中，这些纳米颗粒可能会与血清蛋白结合，形成所谓的“蛋白冠”（protein corona, PC），从而改变其大小、电荷以及与细胞膜的相互作用，最终影响其在体内的递送效率。因此，为了解决这一问题，研究团队提出了一种新的策略：通过在纳米颗粒表面预涂覆人血清白蛋白（human serum albumin, HSA）来防止蛋白冠的形成，从而提高miRNA的递送效率。这种预涂覆的纳米颗粒被命名为“albuplexes”，并被评估其在不同条件下的稳定性、细胞摄取能力和生物效应。

在实验过程中，研究团队首先制备了cNLCs，并通过调整miRNA与cNLC的配比（1:2.5和1:5），形成miRNA/cNLC复合物（NLCplexes）。随后，通过逐渐增加HSA的浓度，对NLCplexes进行表面修饰，形成albuplexes。通过动态光散射（DLS）和电泳光散射（ELS）等技术，研究人员分析了albuplexes在不同介质中的粒径、电荷以及分散性。结果显示，随着HSA浓度的增加，粒径逐渐稳定，电荷由正电荷转变为负电荷，这表明HSA成功地覆盖了纳米颗粒表面，形成了稳定的蛋白冠。此外，通过原子力显微镜（AFM）和圆二色光谱（circular dichroism, CD）等技术，研究人员进一步验证了HSA在纳米颗粒表面的稳定性和结构完整性。这些研究不仅展示了albuplexes的物理化学特性，还揭示了HSA对纳米颗粒表面形态的影响。

在生物相容性方面，研究团队通过MTS和LDH实验评估了albuplexes在3T3-L1细胞中的细胞活力和细胞毒性。结果表明，albuplexes在100至400 nM的miRNA浓度下对细胞的毒性较低，细胞活力维持在较高水平。相比之下，未涂覆HSA的NLCplexes表现出一定的细胞毒性，而通过HSA涂覆后，这种毒性显著降低。这表明HSA的涂覆不仅有助于稳定纳米颗粒，还能减少其对细胞的毒性，提高其在体内的安全性和应用潜力。

在细胞摄取研究中，研究团队通过荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscopy, CLSM）评估了albuplexes在3T3-L1细胞中的摄取行为。结果显示，albuplexes在30分钟内迅速被细胞摄取，并且在不同浓度下表现出浓度和时间依赖性的摄取模式。然而，当培养基中存在20%的HSA时，细胞摄取率显著下降，这可能与HSA在细胞膜上的竞争结合有关。此外，通过代谢抑制实验，研究人员发现albuplexes的摄取主要通过网格蛋白介导的内吞作用（clathrin-mediated endocytosis, CME）和大胞吞作用（macropinocytosis）进行，而某些抑制剂如EIPA和nystatin对1:5 albuplexes的摄取具有显著影响，进一步说明了不同内吞途径在albuplexes摄取过程中的作用。

在生物效应方面，研究团队通过油红O染色（Oil Red O staining）和吸收光谱分析，评估了miRNA-27a在3T3-L1细胞中的作用。结果显示，miRNA-27a具有抗脂肪生成的特性，能够显著减少脂滴的积累。这一效应在albuplexes中更为明显，尤其是在1:5的配比下，albuplexes的抗脂肪生成能力显著优于未涂覆的NLCplexes和单独miRNA。此外，通过光镜观察，研究人员发现albuplexes处理的细胞形态更加纤细，与脂肪细胞的典型形态不同，这可能与miRNA-27a对PPARγ表达的抑制有关。PPARγ是脂肪细胞分化过程中的关键调节因子，因此miRNA-27a的抑制作用可能延缓细胞向成熟脂肪细胞的转化，从而发挥其抗脂肪生成的治疗作用。

此外，研究团队还通过凝胶电泳（SDS-PAGE）和紫外-可见光谱（UV-VIS）等方法，进一步验证了HSA在纳米颗粒表面的结合情况。结果显示，HSA在纳米颗粒表面的结合不仅保持了其结构完整性，还增强了其稳定性。通过CD光谱分析，研究人员发现HSA在与cNLCs结合后，其α-螺旋结构并未发生明显变化，甚至在某些情况下有所增强。这表明HSA的结合并未导致其结构的破坏，反而可能通过静电和疏水相互作用增强其稳定性，从而提高纳米颗粒在体内的递送效率。

研究团队还探讨了不同HSA配比对albuplexes稳定性的影响。结果显示，1:5的albuplexes在血清补充的培养基中表现出更好的稳定性，这可能与HSA在纳米颗粒表面的高覆盖率有关。此外，通过动态光散射（DLS）和电泳光散射（ELS）分析，研究团队发现HSA的涂覆显著降低了纳米颗粒在血清环境中的聚集倾向，使其在体内更易于维持稳定的大小和电荷特性。

在实际应用中，albuplexes作为miRNA递送系统的优势在于其高稳定性和增强的细胞摄取能力。研究团队认为，这种策略不仅能够提高miRNA在体内的递送效率，还可能为miRNA治疗肥胖提供新的思路。通过在纳米颗粒表面预涂覆HSA，可以有效防止蛋白冠的形成，提高纳米颗粒的生物相容性，并增强其在体内的靶向性。此外，HSA作为运输蛋白，能够通过其与细胞膜受体的相互作用，促进纳米颗粒的内吞作用，从而提高其在细胞内的递送效率。

尽管albuplexes在体外表现出良好的生物相容性和细胞摄取能力，但研究团队也指出，这一策略仍需进一步的体内研究以验证其在活体中的应用潜力。未来的研究可以关注albuplexes在脂肪组织中的靶向性，以及其在小鼠模型中的实际效果。此外，研究团队还建议通过进一步的实验，探索不同HSA配比对纳米颗粒表面特性的影响，以及HSA在不同生物环境中的行为特征。这些研究将有助于优化albuplexes的结构和功能，使其更适用于临床应用。

综上所述，这项研究通过将miRNA-27a与cNLCs结合，并进一步涂覆HSA，成功开发了一种新型的miRNA递送系统。该系统不仅提高了miRNA的稳定性，还增强了其在细胞内的摄取效率，从而为miRNA治疗肥胖提供了新的可能性。然而，这一策略仍需进一步的体内实验和临床验证，以确保其在实际应用中的安全性和有效性。未来的研究可以进一步探索albuplexes在不同组织中的靶向性，以及其在肥胖相关疾病中的治疗潜力。此外，研究团队还建议对不同HSA配比的albuplexes进行更深入的分析，以优化其结构和功能，使其更适用于临床应用。