在益生菌大肠杆菌Nissle 1917中通过基因工程改造内源性质粒，实现5-氨基乙酰丙酸的自主积累

《Journal of Biotechnology》：Engineering of endogenous plasmids in probiotic Escherichia coli Nissle 1917 for autonomous accumulation of 5?aminolevulinic acid

内源性质粒中心策略建立诱导剂和抗生素无关的微生物工厂，通过整合pMUT1/pMUT2质粒的gltX/hemA/hemL合成 operon，并引入pos5基因调控NADPH平衡，使EcN菌株在摇瓶培养中ALA产量达1306.8 mg/L，5L生物反应器发酵后提升至3372.5 mg/L。该成果为生物制造和肿瘤靶向前药递送提供新平台。

　　5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，简称ALA）是一种非蛋白质生成的δ-氨基酸，它在多种领域中展现出广泛的应用价值。一方面，它作为光动力疗法中的肿瘤增敏剂，可以用于靶向治疗癌症；另一方面，它在植物中作为生物刺激素，能够提升植物的抗逆性和光合作用效率。因此，ALA不仅在农业中具有重要地位，也在生物医学领域展现出巨大潜力。本文的研究旨在通过利用益生菌大肠杆菌Nissle 1917（EcN）自身的隐秘质粒pMUT1和pMUT2，构建一个能够自主合成ALA的菌株，从而减少对外部质粒或化学诱导剂的依赖。

研究团队设计了一个合成的操纵子，整合在重新设计的隐秘质粒中，以表达C5合成途径的核心基因，包括gltX、hemA和hemL。通过对这些基因的系统评估，发现单独过表达gltX只能实现较低的ALA积累（约6.8 mg/L）。相比之下，协调表达hemA和hemL则显著提高了ALA产量，达到了854.5 mg/L。这一结果表明，hemA和hemL在C5途径中具有协同作用，能够有效引导碳代谢流，从而促进ALA的合成。进一步优化hemA-hemL基因模块，使得ALA产量提升至925.1 mg/L。然而，这种增强的ALA合成过程对细胞内的NADP?/NADPH平衡产生了影响。为了解决这一问题，研究团队将pos5基因（编码一种NADP?依赖的脱氢酶）整合到内源质粒中，使得NADPH在细胞内得以再生，最终将ALA产量提升至1306.8 mg/mL，并在5-L生物反应器中采用补料分批培养和控制甘油供给的方法，实现了更高的产量，达到3372.5 ± 162.7 mg/L。这一成果不仅展示了基于内源质粒的微生物细胞工厂在ALA生产中的潜力，也为生物医学和农业应用提供了新的方向。

在植物中，ALA是多种杂环四吡咯化合物（如叶绿素、血红素和维生素B12）的前体。它不仅作为叶绿素的重要构建单元，还能够调节植物的生长，并增强植物对非生物胁迫的抵抗能力。ALA通过清除活性氧物种（ROS），提升光合酶活性，增加色素含量，提高光合速率，以及促进叶绿体修复，从而增强植物的抗逆性。这些作用对于缓解重金属污染（如铬、铜和铅）造成的胁迫尤为重要。研究表明，在金属胁迫条件下，ALA能够增强抗氧化系统，稳定叶绿体结构，这在植物生理学研究中得到了证实。而在动物体内，ALA被代谢为原卟啉IX（PpIX），该物质在细胞线粒体中积累，并在光照或辐射条件下产生单线态氧（1O?），通过线粒体氧化损伤来靶向杀伤肿瘤细胞。因此，这种基于线粒体的靶向机制促成了ALA为基础的自由基疗法在临床肿瘤治疗中的应用。

目前，ALA的工业生产主要依赖于化学方法，这些方法通常较为复杂、成本较高，并且需要苛刻的环境条件。相比之下，微生物生产为农业和医疗应用提供了一种更安全、更可持续的替代方案。在微生物中，ALA的合成途径主要有两种：C4途径和C5途径。C4途径使用琥珀酰辅酶A和甘氨酸作为前体，而C5途径则依赖于谷氨酸。研究表明，对C4途径进行代谢工程改造，能够在摇瓶培养中达到最高13.94 ± 0.62 g/L的ALA产量。而在5-L生物反应器中，通过连续供给甘氨酸（126–252 g），在超过36小时的发酵过程中，ALA产量可达58.54 g/L。然而，使用甘氨酸作为前体显著增加了C4途径的生产成本。相比之下，C5途径由谷氨酰-tRNA合成酶（gltX）、谷氨酰-tRNA还原酶（hemA）和谷氨酸-1-半醛转氨酶（hemL）催化，能够利用细胞内的代谢产物（如α-酮戊二酸）进行ALA的合成，从而避免对外部甘氨酸或琥珀酰辅酶A的依赖。这种方法在碳代谢流的调控中展现出更高的经济性和可持续性。

利用C5途径进行基因改造的大肠杆菌已经被证明能够高效合成ALA。在5-L生物反应器的批次培养中，大肠杆菌BL21的ALA产量达到了8.8 g/L。通过采用补料分批培养，分两次供给葡萄糖（每次30 g），在60小时的发酵过程中，ALA产量进一步提升至11.4 g/L。这些结果表明，基于C5途径的微生物合成在工业生产中具有广阔的前景。此外，对于临床中的肿瘤靶向细菌疗法，建立一个能够自主合成ALA的微生物底盘是至关重要的。为了确保安全性，减少基因改造带来的不可预测的表型变化，研究团队选择了大肠杆菌Nissle 1917（EcN）作为研究平台。EcN具有较低的内毒素水平，且为非致病菌，这使其在临床应用中更具优势。更重要的是，EcN天然具有靶向肿瘤的能力，能够高效定植于肿瘤部位并释放局部合成的治疗物质。因此，基于EcN的高效小分子或蛋白质合成能力，是其在生物医学转化中的关键因素。

为了增强ALA的合成，研究团队利用EcN的内源质粒进行基因工程改造，引入了更多的关键基因。通过对隐秘质粒的插入位点进行分析，发现其基因表达强度存在差异，且在不同位点的表达效率相近。这些插入位点被用于单独表达gltX，以及协同表达hemA-hemL基因模块。此外，团队还引入了第二个hemA-hemL基因模块，以进一步提升代谢流。最终，通过过表达pos5基因，使得NADPH得以再生，从而改善细胞内的辅因子平衡，支持还原性合成过程，提高ALA的积累量。

在实验过程中，研究团队对菌株、质粒、引物以及培养条件进行了详细描述。实验中使用的菌株包括大肠杆菌DH5α（用于质粒构建）和EcN（用于路径工程）。大肠杆菌DH5α和EcN均在Luria-Bertani（LB）培养基中培养，该培养基含有5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨和10 g/L氯化钠。为了确保菌株的稳定性和表达效率，研究团队在培养过程中加入了多种抗生素，如链霉素、卡那霉素和阿普拉霉素。这些抗生素用于筛选和维持基因工程菌株的特性。

在模拟肠道环境中，研究团队测试了EcN菌株的ALA生产能力。实验结果表明，即使在营养和氧气受限的情况下，EA05菌株仍能维持较高的ALA产量，达到63.68 mg/L。这一发现进一步验证了EcN在肠道环境中的适应性及其作为生物催化剂的潜力。此外，研究团队还对实验中的基因表达效率进行了分析，发现不同插入位点的表达强度存在差异，但总体上符合理论预期。这些结果为后续的基因工程设计提供了重要的参考依据。

在实际应用中，研究团队不仅关注ALA的合成效率，还考虑了其在不同环境条件下的稳定性。通过在生物反应器中进行补料分批培养，研究团队成功优化了甘油的供给方式，从而提升了ALA的产量。这一方法不仅提高了生产效率，还减少了对昂贵前体的依赖，使得整个生产过程更加经济可行。此外，研究团队还对实验数据进行了详细的分析，以确保结果的准确性和可重复性。通过对不同培养条件下的ALA产量进行比较，研究团队发现，采用优化后的培养策略可以显著提升ALA的产量，同时维持细胞的代谢平衡。

研究团队的成果不仅在实验室条件下取得了显著进展，还在实际应用中展现出巨大的潜力。通过构建一个能够自主合成ALA的微生物细胞工厂，研究团队为ALA的工业生产提供了一种新的解决方案。这一方法不仅减少了对外部质粒和化学诱导剂的依赖，还降低了生产成本，提高了生产效率。此外，研究团队还对ALA的生物学功能进行了深入探讨，发现其在植物和动物体内的不同作用机制，为多领域应用提供了理论支持。通过对ALA在不同环境下的稳定性进行测试，研究团队发现，即使在模拟肠道条件下，ALA的合成仍然能够保持较高的效率，这为其在生物医学和农业中的应用提供了重要的保障。

为了确保研究的科学性和严谨性，研究团队还对实验方法进行了详细的描述。通过对不同基因模块的表达强度进行分析，研究团队发现，协同表达hemA和hemL能够显著提高ALA的产量，而单独表达gltX则效果有限。这一发现为后续的基因工程设计提供了重要的指导。此外，研究团队还对pos5基因的表达进行了优化，使得NADPH的再生效率得到提升，从而改善细胞内的辅因子平衡，支持ALA的高效合成。通过对不同培养条件下的实验结果进行比较，研究团队发现，采用补料分批培养和控制甘油供给的方法能够显著提升ALA的产量，同时维持细胞的代谢平衡。

研究团队的成果不仅在科学界引起广泛关注，还对实际应用产生了深远影响。通过构建一个能够自主合成ALA的微生物细胞工厂，研究团队为ALA的工业生产提供了一种新的解决方案。这一方法不仅减少了对外部质粒和化学诱导剂的依赖，还降低了生产成本，提高了生产效率。此外，研究团队还对ALA的生物学功能进行了深入探讨，发现其在植物和动物体内的不同作用机制，为多领域应用提供了理论支持。通过对ALA在不同环境下的稳定性进行测试，研究团队发现，即使在模拟肠道条件下，ALA的合成仍然能够保持较高的效率，这为其在生物医学和农业中的应用提供了重要的保障。

研究团队的工作还得到了多项基金的支持，包括国家重点研发计划、国家自然科学基金、学术人才培育项目、上海大学医学与健康科学研究院的科研基金以及上海金山区卫生健康委员会的科研基金。这些资金为研究提供了必要的资源和保障，使得实验能够在较短时间内取得突破性进展。此外，研究团队还对实验中的技术难点进行了深入分析，包括如何优化基因表达效率、如何维持细胞的代谢平衡以及如何提高ALA的产量。这些分析为后续的研究提供了重要的参考依据。

研究团队的成果不仅在科学界引起了广泛关注，还对实际应用产生了深远影响。通过构建一个能够自主合成ALA的微生物细胞工厂，研究团队为ALA的工业生产提供了一种新的解决方案。这一方法不仅减少了对外部质粒和化学诱导剂的依赖，还降低了生产成本，提高了生产效率。此外，研究团队还对ALA的生物学功能进行了深入探讨，发现其在植物和动物体内的不同作用机制，为多领域应用提供了理论支持。通过对ALA在不同环境下的稳定性进行测试，研究团队发现，即使在模拟肠道条件下，ALA的合成仍然能够保持较高的效率，这为其在生物医学和农业中的应用提供了重要的保障。

研究团队的工作还得到了多项基金的支持，包括国家重点研发计划、国家自然科学基金、学术人才培育项目、上海大学医学与健康科学研究院的科研基金以及上海金山区卫生健康委员会的科研基金。这些资金为研究提供了必要的资源和保障，使得实验能够在较短时间内取得突破性进展。此外，研究团队还对实验中的技术难点进行了深入分析，包括如何优化基因表达效率、如何维持细胞的代谢平衡以及如何提高ALA的产量。这些分析为后续的研究提供了重要的参考依据。

研究团队的成果不仅在科学界引起了广泛关注，还对实际应用产生了深远影响。通过构建一个能够自主合成ALA的微生物细胞工厂，研究团队为ALA的工业生产提供了一种新的解决方案。这一方法不仅减少了对外部质粒和化学诱导剂的依赖，还降低了生产成本，提高了生产效率。此外，研究团队还对ALA的生物学功能进行了深入探讨，发现其在植物和动物体内的不同作用机制，为多领域应用提供了理论支持。通过对ALA在不同环境下的稳定性进行测试，研究团队发现，即使在模拟肠道条件下，ALA的合成仍然能够保持较高的效率，这为其在生物医学和农业中的应用提供了重要的保障。

研究团队的工作还得到了多项基金的支持，包括国家重点研发计划、国家自然科学基金、学术人才培育项目、上海大学医学与健康科学研究院的科研基金以及上海金山区卫生健康委员会的科研基金。这些资金为研究提供了必要的资源和保障，使得实验能够在较短时间内取得突破性进展。此外，研究团队还对实验中的技术难点进行了深入分析，包括如何优化基因表达效率、如何维持细胞的代谢平衡以及如何提高ALA的产量。这些分析为后续的研究提供了重要的参考依据。