DCB诱导的细胞壁缺陷烟草BY-2细胞的形态学与生物生产潜力及转录组分析

《Journal of Biotechnology》：Morphology and Bioproduction Potential of DCB-Induced Cell Wall-Deficient Tobacco BY-2 Cells and Transcriptomic Analysis

细胞壁缺陷的BY-2细胞通过DCB处理显著提升重组蛋白生产效率，EGFP和EPO产量分别提高2.1-2.8倍和35倍，转录组分析显示纤维素合成基因下调及支链多糖合成基因上调。

　　植物细胞培养，尤其是烟草BY-2细胞，被认为是重组蛋白生产的有前景平台。然而，其全部潜力仍受到一些挑战的限制。其中，一些问题如蛋白质分泌效率低下、大液泡的存在以及冷冻保存的困难，可以归因于植物细胞壁的刚性结构。为了解决这些问题，我们通过逐步适应烟草BY-2细胞于细胞壁合成抑制剂2,6-二氯苯腈（DCB）中，开发并表征了细胞壁缺陷型的BY-2细胞。这些经过DCB处理的细胞表现出显著的形态变化，包括由于果胶过量积累而导致的细胞聚集体形成，以及细胞壁中纤维素含量减少了约80%。尽管这些改变存在，DCB处理后的BY-2细胞仍保持了稳健的生长能力，并表现出高效的农杆菌介导转化能力。在模型蛋白EGFP和治疗性蛋白人EPO的生产与分泌水平方面，DCB处理后的细胞比原生BY-2细胞分别提高了2.1至2.8倍。然而，当EGFP与一个羟脯氨酸-O-糖基化模块（SP）??融合后，其分泌水平却显著增强，达到了35倍左右。转录组分析揭示了广泛的基因表达变化，包括参与纤维素生物合成的基因下调以及与分支果胶多糖合成相关的基因上调。这些结果为开发细胞壁缺陷型的植物细胞系作为高效的重组蛋白生产平台提供了概念验证，为未来进一步工程化植物细胞作为下一代生物工厂奠定了基础。

植物细胞作为生产治疗性蛋白的替代平台，在工业规模上已被证明是成本效益较高的选择。与微生物和哺乳动物细胞系统相比，植物细胞的关键优势包括较低的制造成本、易于扩大生产规模、较低的人类病原体污染风险以及能够执行复杂的糖基化反应（Schillberg和Finnern，2021；Xu等，2012；Xu等，2025）。在过去二三十年中，植物细胞培养系统的显著进步带来了多个商业成功案例。例如，taliglucerase alfa（Elelyso?）和pegunigalsidase alfa（Elfabrio?）都是通过植物细胞培养平台生产的，已被美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗戈谢病和法布里病（Germain和Linhart，2024；Tekoah等，2015）。这些成功案例凸显了植物细胞在生物制药领域的巨大潜力。

烟草Bright Yellow-2（BY-2）细胞系因其在生物生产和基础研究中的关键作用，被广泛认为是植物分子农业中的“中国仓鼠卵巢（CHO）细胞”和植物生物学中的“HeLa细胞”（Karki等，2021）。它具备许多有利的特性，包括快速的生长速度（细胞倍增时间最短可达11小时）、强大的适应能力、高效的农杆菌介导转化以及能够实现细胞周期同步化的能力（Hellwig等，2004；Xu等，2011）。迄今为止，BY-2细胞已被成功用于表达多种功能性蛋白，包括抗体、疫苗、酶、生长因子和细胞因子（Uddhab等，2021）。然而，基于BY-2细胞的生物生产系统仍然面临重大挑战，如低蛋白产量和分泌效率、冷冻保存的困难以及非人类糖基化模式的存在，这些问题都阻碍了其商业化进程（Xu等，2025）。

虽然近年来基因组编辑技术的进步在一定程度上解决了糖基化问题，通过敲除负责植物特异性糖基化的糖基转移酶（Hanania等，2017；Mercx等，2017），但要完全释放BY-2细胞作为稳健生物生产平台的潜力，仍需克服其他挑战。与动物细胞相比，植物细胞具有独特的细胞壁结构，由一系列相互连接的多糖组成，形成厚而半渗透的刚性屏障。虽然这种结构对植物在自然环境中的生长至关重要，但在体外培养的植物细胞，如BY-2细胞中，这种细胞壁结构可能并非必需。在优化的培养条件下，如特定的培养基组成、pH控制、温度调节和氧气供应，BY-2细胞可以实现快速增殖。然而，细胞壁的存在直接或间接地引入了多个技术挑战，包括细胞聚集体形成、蛋白质分泌受限、大液泡的产生以及冷冻保存的困难（Karki等，2021；Xu等，2025）。

大液泡的形成是植物细胞的一个显著特征，其占据细胞体积的高达90%。这种结构不仅减少了细胞质空间，从而限制了蛋白质合成的容量，还阻碍了高细胞干重的积累（Schillberg等，2019）。此外，刚性细胞壁与大液泡的结合，对精英植物细胞系的冷冻保存构成了重大障碍，进一步复杂化了建立高效的植物基生物生产系统的进程。

本研究的长期目标是开发一种新型的植物细胞系，该细胞系缺乏刚性的细胞壁结构，称为细胞壁缺陷型（Cwd）细胞，以解决植物细胞培养作为替代生物生产平台的关键限制。虽然这一目标可以通过现代分子生物学工具，特别是基因组编辑技术来实现，但进展仍然缓慢，这主要是由于对植物细胞壁组装、重塑及其相关基因的有限理解（Keegstra，2010；Lampugnani等，2018）。作为一种替代方法，可以通过化学处理，如使用细胞壁降解酶或纤维素合成抑制剂，直接从原生细胞系生成具有显著降低纤维素含量的伪细胞壁缺陷型（pseudo Cwd）植物细胞。例如，通过将番茄和烟草细胞逐渐适应于含有DCB的培养环境中，成功生成了伪Cwd细胞。这些DCB处理后的细胞的细胞壁显示出纤维素和木葡聚糖含量的显著减少，果胶聚合物的富集，以及张力强度的明显下降（Shedletzky等，1990；Shedletzky等，1992）。

由于其细胞壁结构中缺乏纤维素-木葡聚糖网络，通过化学诱导生成的伪Cwd细胞系为研究潜在Cwd植物细胞提供了一个独特且快速的模型。这种系统允许在不进行广泛基因改造的情况下，研究这些细胞的特性及其生物生产潜力。在本研究中，我们通过逐步增加DCB浓度，从5μM到20μM，成功生成了CwdBY-2细胞。在适应过程中，BY-2细胞开始形成直径在2至6毫米之间的聚集体，并向培养基中分泌大量浑浊物质。这种浑浊物质最可能为过量产生的果胶材料。通过系统分析和比较CwdBY-2细胞与原生BY-2细胞的形态、细胞壁结构组成、生长特性、生物生产性能以及转录组特征，本研究为开发细胞壁缺陷型植物细胞提供了概念验证，为未来细胞工程的进一步发展奠定了基础。

在本研究中，我们探讨了DCB处理对BY-2细胞的影响。原生BY-2细胞在直接培养于含有20μM DCB的NT-1液体培养基中时无法存活，这表明需要一个逐步适应的过程。在适应过程中，细胞开始形成较大的聚集体，并分泌大量浑浊物质，这些现象可能与果胶的过量积累有关。细胞壁的结构变化不仅影响了细胞的形态，还对它们的生物生产性能产生了深远影响。在DCB处理后的细胞中，参与纤维素生物合成的基因表达被显著下调，而与分支果胶多糖合成相关的基因则被显著上调。这种基因表达的改变可能与细胞壁结构的重塑直接相关，从而影响了细胞的分泌能力。

在实际应用中，细胞壁缺陷型的植物细胞可能具有更高的蛋白质分泌效率，这使得它们成为生产重组蛋白的更有利的平台。然而，这种细胞壁结构的改变也可能带来一些新的挑战，如细胞的稳定性、生长条件的优化以及潜在的代谢产物积累。因此，在进一步研究中，需要评估这些细胞在长期培养中的表现，并探索其在不同生产条件下的适应性。此外，还需要研究这些细胞在不同蛋白表达系统中的表现，以确定其是否适用于多种蛋白质的生产。

细胞壁的缺失可能对细胞的物理特性产生显著影响，例如细胞的形状、大小和内部结构。这些变化可能影响细胞的生长速度、细胞周期调控以及对培养条件的响应能力。因此，在研究细胞壁缺陷型植物细胞时，需要综合考虑这些因素，并通过系统的实验设计来评估其在不同条件下的表现。此外，细胞壁的缺失可能影响细胞的渗透性和细胞膜的稳定性，这可能对细胞的存活和功能产生影响。

在生物生产过程中，细胞的分泌能力是衡量其生产效率的重要指标。通过逐步适应DCB，我们观察到细胞壁缺陷型的BY-2细胞在分泌能力方面显著提升。这种提升可能与细胞壁结构的改变直接相关，因为细胞壁的缺失可能减少了对分泌蛋白的物理阻碍，从而提高了其向培养基中释放的效率。此外，细胞壁的缺失可能改变了细胞的内部环境，例如细胞质的浓度和细胞器的分布，从而影响了蛋白质的合成和分泌过程。

除了分泌能力的提升，细胞壁缺陷型的植物细胞可能在其他方面也表现出优势。例如，它们可能更容易进行冷冻保存，因为细胞壁的缺失可能减少了细胞在低温条件下的机械损伤风险。此外，这些细胞可能更容易进行细胞同步化，从而提高生产过程的可控性和一致性。然而，这些优势是否能够转化为实际的生产效益，还需要进一步的实验验证和优化。

在实际应用中，细胞壁缺陷型的植物细胞可能需要特殊的培养条件来维持其生长和功能。例如，培养基的组成、pH值、温度和氧气供应都需要进行调整，以适应这些细胞的特殊需求。此外，还需要研究这些细胞在不同培养条件下的稳定性，以确保其在大规模生产中的可行性。这些研究将有助于开发更高效的植物细胞培养系统，并推动其在生物制药领域的应用。

总的来说，本研究为开发细胞壁缺陷型的植物细胞提供了重要的概念验证。通过逐步适应DCB，我们成功生成了CwdBY-2细胞，并观察到其在形态、生长、生物生产性能和基因表达方面的显著变化。这些结果表明，细胞壁缺陷型的植物细胞可能成为提高重组蛋白生产效率的有前景平台。然而，要实现这一目标，还需要进一步的研究和优化，以解决细胞壁缺陷可能带来的新挑战，并确保这些细胞在实际生产中的稳定性和高效性。未来的研究可以集中在开发更高效的细胞壁工程策略，以进一步提升植物细胞的生物生产性能，并探索其在不同蛋白表达系统中的应用潜力。