通过递归高压均质化提高细菌包涵体的纯度和再折叠产率

《Journal of Biotechnology》：Increased purity and refolding yield of bacterial inclusion bodies by recursive high pressure homogenization

提高包涵体纯度的递归高压均质化策略显著提升了单链抗体折叠浓度至855 mg/L，同时降低CO?足迹18%，产量达7.84 g/kg，无需新增设备或化学物质。

　　在现代生物制药领域，使用重组技术生产治疗性蛋白已成为一种常见的方法。其中，大肠杆菌（*Escherichia coli*）因其高产率和易于操控的生物学特性，仍然是最广泛使用的微生物宿主。然而，当在大肠杆菌中高表达蛋白时，这些蛋白常常以不溶性形式聚集，形成所谓的包含体（inclusion bodies, IBs）。包含体的分离和纯化是生产过程中关键的一步，因为它们必须经过溶解和重折叠，才能恢复为具有生物活性的蛋白质。目前，工业上普遍采用的重折叠方法是通过将溶解后的物质稀释在重折叠缓冲液中，但这种方法存在诸多问题，如重折叠效率低、化学品和水的消耗量大、设备占用空间多，从而影响了整个过程的可持续性和经济性。

为了提高包含体的重折叠效率，从而实现更高的产品浓度，本研究提出了一种新的处理策略，即“递归高压均质化”（recursive high pressure homogenization, rHPH）。该方法将包含体洗涤与额外的均质化步骤结合，以提升包含体的纯度，从而减少重折叠过程中的蛋白聚集。我们通过比较传统的“线性洗涤”（linear washing）与新的递归策略，分析了不同处理方式对包含体纯度、细胞裂解程度和核酸释放的影响。研究总共评估了七种不同的早期下游处理（early downstream processing, early DSP）方案，并通过溶解和重折叠实验，评估了这些方案对最终产品浓度的影响。

通过实验发现，最有效的处理方案在重折叠后达到了855 ± 48 mg/L的产品浓度，这比传统线性洗涤方案提升了14%。此外，递归高压均质化策略还带来了约18%的二氧化碳足迹减少，这主要是因为减少了尿素的使用量。同时，产品产量每千克生物质也从5.17 g增加到了7.84 g，而无需引入非标准设备或化学品。这表明，递归高压均质化不仅提高了包含体的纯度，还优化了整个生产流程的环境友好性。

本研究中，我们对包含体的纯度进行了多方面的分析，包括通过差速离心沉降（differential centrifugal sedimentation, DCS）评估颗粒大小分布，通过紫外吸收比（A260/A280）测量核酸杂质含量，以及通过电子显微镜（scanning electron microscopy, SEM）观察包含体的形态变化。结果表明，随着均质化次数的增加和压力的提升，细胞裂解程度和核酸释放量也随之增加。特别是，在采用递归策略时，包含体的纯度得到了进一步提升，而不仅仅是通过细胞裂解。例如，对于使用4次1000 bar均质化的处理方案（RP7P1,000），其包含体纯度达到了97.4 ± 0.8%，且A260/A280比值降至0.62，这表明核酸杂质已被有效去除。

在实验设计上，我们考虑了两种不同的生物质处理方式：新鲜收获的生物质和冷冻保存的生物质。对于新鲜生物质，我们采用了不同的均质化次数和压力进行处理，而冷冻生物质则在处理前进行了解冻。通过比较这些处理方案，我们发现，即使在相同的均质化次数和压力下，递归策略仍能提高包含体的纯度。这可能是因为在递归处理过程中，额外的均质化步骤有助于进一步去除残留的细胞碎片和杂质，从而提升了包含体的纯度和重折叠效率。

此外，我们还分析了包含体溶解后的粘度变化。粘度的降低通常意味着更易处理的溶液，这对于工业上的过滤和后续操作至关重要。实验结果显示，经过递归处理的包含体溶解液粘度显著降低，这有助于提高过滤效率，减少能源消耗和操作时间。同时，粘度的降低也意味着处理过程中对设备的负担减少，进一步提高了整个生产流程的可持续性。

在环境影响评估方面，我们计算了尿素消耗导致的二氧化碳足迹，并与递归高压均质化过程中额外能源消耗带来的足迹进行了比较。结果显示，尿素的减少带来了显著的环境效益，而递归处理引入的额外能源消耗则相对较小，因此整体上，该策略有助于实现更环保的蛋白质生产。这些结果对于推动生物制药行业的可持续发展具有重要意义，尤其是在当前全球对绿色制造和减少碳排放日益关注的背景下。

本研究的另一个重要发现是，包含体的纯度与其重折叠效率之间存在密切关系。高纯度的包含体在重折叠过程中更少受到杂质的影响，从而提高了最终产品的产量和活性。这一发现不仅适用于本研究中的单链抗体片段（scFvM），还可能推广到其他类型的蛋白质生产中。因此，未来的蛋白质生产流程应更加注重包含体纯度的提升，而不是仅仅关注重折叠的效率。

在实际应用中，递归高压均质化策略的优势在于其无需引入额外的化学品或设备，这使得该方法在工业实施中更具可行性。同时，该方法在提高产品浓度和减少环境影响方面表现出色，为蛋白质生产的优化提供了新的思路。此外，该策略还可以减少溶剂的使用量，从而降低生产成本和对环境的影响。

综上所述，本研究通过优化包含体的早期下游处理，提出了一种递归高压均质化策略，该策略不仅提高了包含体的纯度，还显著提升了最终产品的产量和环境友好性。这些成果为蛋白质生产的可持续发展提供了新的方向，并为未来的工业应用奠定了基础。