代谢糖工程化外泌体-A2M纳米平台通过重编程巨噬细胞极化治疗股骨头坏死

《Cell Death Discovery》：Metabolic glycoengineered exosome-A2M nanoplatform reprograms macrophage polarization and orchestrates bone regeneration in ONFH

本研究针对糖皮质激素诱导的股骨头坏死(ONFH)中M1巨噬细胞极化失衡难题，开发了DS-exo@A2M纳米平台。该平台通过IL-4信号通路协同抑制M1极化(↓TNF-α/IL-6)并促进M2极化(↑CD206/Arg-1)，显著改善骨微结构(↑BV/TV,↓Tb.Sp)并促进BMSCs成骨分化(↑RUNX2/ALP/OCN)，为炎症性骨病提供了新型治疗策略。

　　

股骨头坏死(osteonecrosis of the femoral head, ONFH)是一种由股骨头血供中断导致的严重骨科疾病，其特征是骨细胞死亡和结构破坏。长期使用糖皮质激素是ONFH的主要诱因之一，它会引发巨噬细胞极化失衡，导致促炎的M1表型占主导地位，破坏炎症稳态，加剧骨坏死。目前，ONFH的治疗仍面临巨大挑战，尤其是针对炎症微环境调控的有效策略尚显不足。

在这一背景下，研究人员将目光投向了具有天然生物相容性的外泌体(exosomes)。这些30-150纳米的纳米囊泡能够介导细胞间通讯，并具有低免疫原性和良好的屏障穿透能力。然而，天然外泌体存在靶向性不足的局限。为了突破这一瓶颈，Peng Chen、Ruisong Wang和Shanhong Fang团队在《Cell Death Discovery》上报道了一项创新研究：他们通过代谢糖工程(metabolic glycoengineering, MGE)技术对脂肪间充质干细胞来源的外泌体(ADMSC-Exos)进行工程化改造，并加载α₂-巨球蛋白(alpha-2-macroglobulin, A2M)，构建了DS-exo@A2M纳米平台，旨在重编程巨噬细胞极化，重塑ONFH的炎症微环境，促进骨再生。

研究采用的主要关键技术方法包括：通过代谢糖工程和点击化学制备靶向巨噬细胞清道夫受体A(SR-A)的DS-exo；利用电穿孔技术将从小鼠血浆中提取的A2M(约180 kDa)加载到外泌体中构建DS-exo@A2M；通过纳米颗粒追踪分析(NTA)、透射电子显微镜(TEM)和Western Blot对工程化外泌体进行表征；建立糖皮质激素诱导的大鼠ONFH模型进行体内疗效评估；运用RNA测序(RNA-seq)和蛋白质组学分析分子机制；采用shRNA技术沉默IL-4基因进行功能验证。

Preparation and characterization of engineered exosomes loaded with A2M

研究人员首先通过MGE介导的点击化学将DBCO修饰的cy5.5标记的硫酸葡聚糖(dextran sulfate, DS)连接到ADMSC表面，获得了能够靶向巨噬细胞SR-A受体的DS-exo。透射电镜显示DS-exo保持了天然外泌体的圆形或椭圆形膜结合囊泡形态，粒径略有增加(141.7±8.1 nm vs 123.2±7.3 nm)。Western Blot证实DS-exo高表达外泌体标志物CD63、CD9和TSG101，而内质网标志物Calnexin几乎不表达。随后通过电穿孔将A2M成功加载到DS-exo中，构建的DS-exo@A2M平均直径为150.20±18.1 nm，Zeta电位为-11.88 mV，且A2M表达显著升高，表明纳米平台构建成功。

DS-exo@A2M promotes macrophage reprogramming and BMSC osteogenic differentiation in ONFH

体外实验显示，Cy5.5标记的DS-exo@A2M能够被巨噬细胞有效摄取。在LPS诱导的M1巨噬细胞中，DS-exo@A2M处理显著降低了M1标志物CD86的荧光强度，同时提高了M2标志物CD163的表达。RT-qPCR结果进一步证实DS-exo@A2M下调M1标记基因(CD80、CD86、IL-1β)并上调M2标记基因(CD163、IL-10)。更重要的是，在与DS-exo@A2M处理的巨噬细胞共培养后，骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs)的成骨分化能力显著增强，表现为碱性磷酸酶(ALP)和阿尔新蓝(ARS)染色加深，成骨标志物Runx2、Osterix、Alpl、Opn和Ocn在基因和蛋白水平上的表达均明显上调。

DS-exo@A2M promotes macrophage reprogramming by IL-4

为阐明机制，研究人员对DS-exo@A2M处理的M1巨噬细胞进行了RNA测序和蛋白质组学分析。RNA-seq鉴定出1517个差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)，其中888个上调，629个下调。基因集富集分析(GSEA)显示先天免疫系统通路显著下调。通过与M2巨噬细胞相关基因的Venn分析，筛选出15个M2相关DEGs(M2-DEGs)。蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction, PPI)网络分析确定IL-4为核心节点基因，其蛋白表达也显著上调。功能实验证实，IL-4沉默后，DS-exo@A2M促进M2极化和BMSCs成骨分化的能力被显著削弱，表明IL-4是DS-exo@A2M发挥作用的关键下游因子。

DS-exo@A2M promotes reprogramming of macrophages and bone tissue repair in a rat model of ONFH

在糖皮质激素诱导的大鼠ONFH模型中，DS-exo@A2M治疗显著改善了股骨头的骨微结构。Micro-CT显示治疗组骨小梁结构恢复，骨体积分数(bone volume/total volume, BV/TV)和小梁数量(trabecular number, Tb.N)显著增加，小梁分离度(trabecular separation, Tb.Sp)降低。组织学分析(H&E和Masson染色)显示治疗组有新骨形成和更成熟的胶原纤维。免疫组化证实成骨诱导蛋白BMP2表达升高。机制上，免疫荧光和流式细胞术显示DS-exo@A2M治疗降低了M1标志物CD86表达，提高了M2标志物CD163表达。RT-qPCR和Western Blot进一步证实股骨头中IL-4和成骨标志物表达上调。安全性评估显示DS-exo@A2M对心、肝、脾、肺、肾等重要器官无显著毒性。

研究结论与讨论部分强调，DS-exo@A2M通过整合外泌体工程、免疫调节和靶向递送策略，有效调控了巨噬细胞M1向M2的表型转化，并通过IL-4信号通路重塑ONFH的炎症微环境，促进骨修复。与传统药物递送系统相比，该纳米平台具有更好的生物相容性、靶向性和治疗效果，同时减少了脱靶效应。多组学分析证实了IL-4在介导巨噬细胞重编程中的核心作用，shRNA沉默实验则验证了通路特异性。

该研究首次将代谢糖工程化外泌体与A2M递送相结合，为ONFH提供了一种精准纳米治疗策略。不仅证实了外泌体工程在骨科疾病治疗中的巨大潜力，也为其他炎症相关性骨病的治疗提供了新思路。尽管存在样本量有限、未评估长期疗效等局限性，但DS-exo@A2M展现出的良好治疗效果和安全性，为其临床转化奠定了坚实基础。未来研究将聚焦于优化给药方案、探索直接成骨作用机制，并拓展其在其他骨科疾病中的应用前景。

这项研究标志着外泌体工程技术在骨再生医学领域的重要突破，通过精准免疫调控为ONFH治疗提供了创新性解决方案，有望推动骨科纳米医学向临床实践迈进。