孕烷X受体通过PI3K/Akt通路抑制凋亡延缓雄性小鼠年龄相关性骨丢失

《Cell Death Discovery》：Pregnane X receptor protects against age-related bone loss in males via PI3K/Akt-mediated inhibition of apoptosis

本研究聚焦年龄相关性骨质疏松的防治难题，揭示了孕烷X受体（Pxr）在维持骨稳态中的新作用。研究人员通过基因敲低、过表达及激动剂干预，证实Pxr可通过激活PI3K/Akt信号通路，减轻骨髓间充质干细胞（BMSCs）的氧化应激、炎症反应和凋亡，从而促进成骨分化、改善老年雄性小鼠的骨质量。该发现为骨质疏松的靶向治疗提供了新思路。

　　

随着年龄增长，骨骼会悄然发生变化——骨量逐渐流失，骨骼微结构遭到破坏，最终导致骨质疏松，大大增加骨折风险。这背后，是成骨细胞介导的骨形成与破骨细胞介导的骨吸收之间的平衡被打破。尽管一些核受体如维生素D受体已被证实参与骨代谢调控，但孕烷X受体（Pxr）——一个在肝脏解毒和代谢中扮演重要角色的转录因子——在骨骼健康中的作用却一直是个谜。近期有研究提示Pxr可能影响成骨细胞分化，但其在衰老骨骼中的具体功能及分子机制尚不清楚，这阻碍了将其作为治疗靶点的潜力探索。

为了解决这一科学问题，来自山东大学齐鲁医院的研究团队在《Cell Death Discovery》上发表了一项研究，系统阐述了Pxr在对抗年龄相关性骨丢失中的保护作用及其机制。他们发现，老年小鼠骨骼中Pxr蛋白表达显著降低，且与成骨标志物（如Osterix、ALP、Ocn）的下调及骨质疏松表型相关。为了验证其因果关系，研究人员利用腺相关病毒（AAV）介导的基因操作技术，在年轻小鼠股骨中局部敲低Nr1i2（编码Pxr的基因），成功模拟了老年性骨丢失的表型；相反，在老年小鼠骨骼中过表达Pxr或使用其激动剂PCN，则能有效改善骨质量。

研究团队主要运用了以下几项关键技术方法：通过AAV局部注射实现小鼠股骨中Pxr的基因敲低或过表达；利用微型电子计算机断层扫描（Micro-CT）进行骨微结构参数定量分析；通过RNA测序（RNA-Seq）筛选差异表达基因并进行GO和KEGG富集分析；从小鼠股骨中分离原代骨髓间充质干细胞（BMSCs）并进行流式细胞术鉴定表型；在体外通过siRNA转染进行基因敲低，并通过Western blot、qPCR、ELISA、Alizarin Red S染色等技术评估成骨分化、氧化应激、炎症因子和凋亡相关蛋白表达；使用分子对接分析Pxr激动剂PCN与Pxr蛋白的结合特性。

Pxr缺陷诱导小鼠骨丢失

研究人员首先确认老年小鼠股骨中Pxr蛋白表达显著低于年轻小鼠。随后，通过股骨髓腔内注射携带shNr1i2的AAV，在年轻小鼠骨骼中特异性敲低Pxr。Micro-CT分析显示，敲低组小鼠在注射6周后出现了明显的骨质疏松表型，包括骨小梁骨密度（Tb.BMD）、骨体积分数（Tb.BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）和厚度（Tb.Th）的降低，以及骨小梁分离度（Tb.Sp）的增加。组织学染色进一步证实了骨小梁数量减少和胶原沉积下降。这些结果表明Pxr缺乏足以诱发骨丢失。

Pxr敲低改变小鼠骨骼转录组谱

为了探索机制，研究人员对股骨组织进行了RNA测序。结果显示，与对照组相比，Pxr敲低导致157个基因显著下调，109个基因显著上调。GO富集分析发现，下调的基因显著富集于骨骼系统发育和骨化等成骨相关生物学过程。KEGG通路分析则提示，磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）信号通路是受Pxr敲低影响最显著的通路之一。qPCR验证进一步表明，Pxr缺陷不仅降低了成骨相关基因的表达，还上调了炎症相关基因（如Tnfa, Il1β），并改变了凋亡相关基因（Bcl2下调，Bax和Casp3上调）的表达，提示局部炎症和细胞凋亡被激活。

Pxr缺陷抑制BMSCs的成骨分化

骨髓间充质干细胞（BMSCs）是成骨细胞的前体细胞。研究人员从小鼠股骨中分离了原代BMSCs，并证实其高表达CD29和CD90，不表达CD34和CD45。有趣的是，成骨诱导后BMSCs中Nr1i2的mRNA表达水平显著升高。在体外利用siRNA敲低BMSCs中的Pxr后，细胞的增殖和成骨分化能力均受到抑制，矿化结节形成减少，成骨相关蛋白（Sp7, ALP, Ocn）表达下调。

Pxr缺陷增加细胞内ROS、抑制PI3K/Akt通路并诱导BMSCs凋亡

机制探索发现，Pxr缺陷的BMSCs培养上清液中促炎细胞因子（TNF-α, IL-1β, IL-6）水平升高。同时，细胞内抗氧化酶（总超氧化物歧化酶T-SOD、谷胱甘肽过氧化物酶GSH-PX）活性降低，氧化损伤标志物丙二醛（MDA）含量升高，活性氧（ROS）荧光探针DCFDA检测显示细胞内ROS水平显著积累。更重要的是，Pxr缺陷抑制了PI3K和Akt的磷酸化激活，并促进了细胞凋亡，表现为抗凋亡蛋白Bcl-2减少，促凋亡蛋白Bax和活化的Caspase-3（cleaved Caspase-3）增加。为了验证氧化应激的关键作用，研究人员给Pxr敲低小鼠注射抗氧化剂谷胱甘肽（GSH），结果发现GSH治疗能显著缓解由Pxr缺陷引起的骨丢失，表明氧化应激是Pxr调控骨稳态的重要下游环节。

Pxr介导的抗凋亡和促成骨作用依赖于PI3K/Akt通路

为了确认PI3K/Akt通路是Pxr功能的下游效应器，研究团队从年轻和老年小鼠中分离BMSCs，进行Pxr过表达，并同时使用PI3K/Akt特异性抑制剂PI3K/AKT-IN-1。结果显示，老年BMSCs的PI3K/Akt通路活性低于年轻BMSCs。Pxr过表达能激活老年BMSCs中的PI3K/Akt通路，并抑制凋亡、促进成骨分化。然而，当加入PI3K/Akt抑制剂后，Pxr过表达带来的这些有益效应被显著削弱。这直接证明了Pxr通过PI3K/Akt通路发挥其保护作用。

AAV介导的Pxr过表达改善老年小鼠骨量

在体实验进一步证实了Pxr的治疗潜力。研究人员将过表达Nr1i2的AAV（AAV-Nr1i2）局部注射入20月龄老年小鼠的股骨中。6周后，与对照组相比，Pxr过表达显著上调了股骨中成骨相关基因的mRNA水平，并明显改善了骨小梁的微结构参数，增加了骨量。

Pxr激动剂PCN改善老年小鼠骨量

考虑到基因治疗的局限性，研究人员探索了药理学激活Pxr的可能性。分子对接分析显示，Pxr激动剂孕烯醇酮16α-腈（PCN）能与小鼠Pxr蛋白的核受体配体结合域高亲和力结合（结合能为-9.4 kcal/mol）。给20月龄老年小鼠连续6周腹腔注射PCN后，Micro-CT分析显示，PCN治疗组小鼠的骨质量显著优于溶剂对照组，骨小梁参数得到全面改善。

综上所述，这项研究首次系统地揭示了Pxr在年龄相关性骨丢失中的关键保护作用。研究结果表明，Pxr通过激活PI3K/Akt信号通路，整合了对BMSCs氧化应激、炎症反应和凋亡过程的调控，从而维持成骨分化能力和骨稳态。Pxr的表达随衰老而下降，其功能缺失会破坏这一平衡，导致骨质疏松。反之，无论是基因水平过表达Pxr，还是药理学激活Pxr，都能有效改善老年雄性小鼠的骨质量。该研究不仅深化了对骨质疏松发病机制的理解，更重要的是将Pxr确立为一个极具潜力的治疗靶点。与现有主要抑制骨吸收或微弱促进骨形成的药物不同，靶向Pxr的策略有望同时发挥促骨形成、抗炎和抗氧化等多重效益，为开发治疗年龄相关性骨质疏松的新型药物提供了重要的理论依据和实验证据。未来的研究可进一步探索Pxr在其他类型骨质疏松（如绝经后骨质疏松）中的作用，以及其在骨折愈合和软骨代谢中的潜在功能。