利用瓜实蝇（Galleria mellonella）模型评估嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）和加氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）对与猪断奶后腹泻（PWD）相关的产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli）的抗菌作用

《The Microbe》：Evaluation of antibacterial properties of Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus gasseri on Enterotoxigenic Escherichia coli associated with porcine post-weaning diarrhea (PWD) using Galleria mellonella model

本研究通过体外和体内实验，评估乳酸杆菌（L. acidophilus、L. gasseri、L. reuteri）对猪后断奶腹泻（PWD）主要病原体产气荚膜梭菌（ETEC）的控制效果。体外实验显示L. acidophilus对ETEC SP11抑制显著，L. gasseri对SP31抑制明显。体内实验采用Galleria mellonella模型，发现预防性接种（4小时前）比共感染更有效，L. acidophilus使SP11感染死亡率降低30%，L. gasseri使SP31死亡率降低18%。RT-qPCR显示益生菌通过调节抗菌肽（如galliomycin）表达增强免疫应答。结论：特定乳酸杆菌在预防性策略中可有效抑制ETEC感染，但效果依赖菌株组合。

　　### 哈里斯粘液模型下的乳酸杆菌与ETEC感染研究

在现代畜牧养殖中，特别是猪的健康管理和疾病预防方面，抗生素和锌氧化物一直被广泛使用，以控制新生仔猪断奶后的腹泻（Post-weaning Diarrhea, PWD）。然而，随着抗生素耐药性问题的日益严重，以及2022年欧盟对锌氧化物的禁用，寻找可持续的替代方案成为当前研究的重点。因此，科学家们开始探索其他可能有效的生物干预手段，如益生菌。益生菌因其对肠道微生物群的调节能力、对病原体的抑制作用以及对宿主免疫系统的支持作用，被认为是一种有潜力的替代品。

在本研究中，科学家们选择了三种可能的益生菌菌株——**乳酸杆菌酸性乳酸菌**（*Lactobacillus acidophilus*）、**乳酸杆菌加斯里**（*Lactobacillus gasseri*）和**利莫西乳酸杆菌**（*Limosilactobacillus reuteri*），以评估它们对**肠毒素产生大肠杆菌**（Enterotoxigenic *Escherichia coli*, ETEC）感染的控制效果。研究首先在体外环境中测试了这些益生菌的抗菌活性，随后在**哈里斯粘液模型**（*Galleria mellonella*）中进行了体内实验，以进一步验证其效果。

### 体外实验：益生菌对ETEC的抑制作用

在体外实验中，研究人员通过**点样法**（spot test agar）和**琼脂扩散法**（agar well diffusion assay）评估了三种益生菌菌株对ETEC菌株的抑制效果。点样法的结果显示，*L. acidophilus* 对 ETEC SP11 的抑制作用最强，其抑制区直径（ZDI）达到了45.61 ± 8.25毫米，而 *L. gasseri* 的抑制区直径仅为21.00 ± 5.22毫米。相比之下，*L. reuteri* 的抑制区直径则介于两者之间，约为34.50 ± 1.55毫米。这表明，在体外实验中，*L. acidophilus* 对 ETEC SP11 的抑制作用最为显著，而 *L. gasseri* 对 ETEC SP31 的抑制效果也较为突出。

在琼脂扩散法中，研究人员进一步分析了益生菌菌株产生的**细胞外代谢产物**（cell-free culture supernatants, CFS）对 ETEC 的抑制作用。结果表明，尽管 *L. acidophilus*、*L. gasseri* 和 *L. reuteri* 的 CFS 均表现出一定的抗菌活性，但它们之间的差异并不显著。CFS 的抑制区直径范围在13.78 ± 0.38毫米至17.56 ± 1.50毫米之间。这一结果提示，益生菌的抗菌作用不仅限于其直接的细菌接触，还可能与它们的代谢产物有关，但这些代谢产物的抗菌效果在不同菌株之间表现出一定的相似性。

### 体内实验：哈里斯粘液模型中的益生菌效果

为了进一步评估这些益生菌在体内的抗菌潜力，研究团队使用了**哈里斯粘液模型**（*Galleria mellonella*），这是一种常用于研究宿主-病原体相互作用和抗菌药物效果的模式生物。该模型具有与哺乳动物相似的先天免疫系统，包括吞噬作用、氧化爆发以及抗菌肽（Antimicrobial Peptides, AMPs）的产生。此外，它还具有成本低、伦理接受度高和易于操作等优势，使其成为研究抗菌效果的理想选择。

在体内实验中，研究人员采用了两种不同的实验方法：**共感染模型**（co-infection）和**预防性模型**（prophylactic approach）。在共感染模型中，益生菌和 ETEC 菌株同时注入到哈里斯粘液幼虫体内，但结果显示，这种方法在控制 ETEC 感染方面并不有效，反而导致幼虫死亡率升高。这可能是因为共感染模型中 ETEC 的浓度较高，导致感染压力过大，使得益生菌难以发挥其抗菌作用。

相比之下，预防性模型在控制 ETEC 感染方面表现出更积极的效果。在该模型中，益生菌菌株首先被注入到幼虫体内，随后在4小时后注入 ETEC 菌株。结果显示，*L. acidophilus* 和 *L. gasseri* 在预防 ETEC 感染方面表现出显著的保护作用。具体而言，当使用 *L. acidophilus* 预防 ETEC SP11 感染时，幼虫的存活率达到了约30%，而对照组的存活率则较低。同样，当使用 *L. gasseri* 预防 ETEC SP31 感染时，幼虫的存活率也显著提高，达到了约18%。这表明，预防性策略比共感染策略更能有效控制 ETEC 感染。

### 抗菌肽的表达与免疫反应

除了评估幼虫的存活率和健康指数外，研究还通过**定量逆转录聚合酶链反应**（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, RT-qPCR）分析了 ETEC 感染后，哈里斯粘液幼虫体内**抗菌肽**（AMPs）的表达水平。抗菌肽是宿主防御机制的重要组成部分，能够有效抑制病原体的生长。研究中关注的 AMPs 包括**溶菌酶**（lysozyme）、**可诱导金属蛋白酶抑制剂**（inducible metalloproteinase inhibitor, IMPI）、**加勒里霉素**（gallerimycin）和**加利莫霉素**（galliomycin）。

在 ETEC SP11 感染的幼虫中，*L. acidophilus* 的预防性处理显著提高了溶菌酶和加利莫霉素的表达水平，而 IMPI 和加勒里霉素的表达则受到一定影响。在 ETEC SP31 感染的幼虫中，*L. gasseri* 的预防性处理同样显示出对溶菌酶和加利莫霉素表达的显著增强，而 IMPI 的表达则表现出更大的变化。这些结果表明，益生菌的使用可能通过调节抗菌肽的表达，增强宿主的免疫反应，从而更有效地控制 ETEC 感染。

### 益生菌与宿主免疫系统的相互作用

研究还探讨了益生菌如何影响宿主的免疫系统。通过分析幼虫的**血细胞数量**（hemocytes），研究人员发现，无论是否使用益生菌，感染后的血细胞数量变化并不显著。这表明，在 ETEC 感染初期，宿主的先天免疫系统并未受到明显影响，而益生菌可能通过其他机制（如抗菌肽的调节）来增强宿主的防御能力。

此外，研究还发现，不同益生菌菌株对 ETEC 感染的调控效果存在显著差异。例如，*L. acidophilus* 和 *L. gasseri* 在预防 ETEC 感染时，能够显著减少幼虫体内的 ETEC 菌落数量，从而降低感染程度。然而，*L. reuteri* 在本实验条件下并未表现出明显的抗菌效果，这可能与其在猪肠道中的分布和活性有关。

### 实验设计与方法

为了确保实验的准确性和可重复性，研究团队采用了多种实验方法，包括**体外抗菌实验**、**体内感染模型**以及**基因表达分析**。在体外实验中，所有益生菌菌株均在含有不同浓度的 ETEC 菌株的琼脂平板上进行培养，并通过测量抑制区直径来评估其抗菌活性。在体内实验中，幼虫被分为多个实验组，分别接受不同处理方式，包括仅使用 ETEC、仅使用益生菌，以及益生菌与 ETEC 的共感染或预防性处理。

在基因表达分析中，研究人员通过 RT-qPCR 技术检测了抗菌肽的表达水平，并发现这些肽的表达水平在不同实验条件下存在显著差异。例如，*L. acidophilus* 预防 ETEC SP11 感染时，加利莫霉素的表达水平显著提高，而在 *L. gasseri* 预防 ETEC SP31 感染时，IMPI 的表达水平则显著上升。这些结果表明，益生菌可能通过调节抗菌肽的表达，增强宿主的免疫反应，从而更有效地控制 ETEC 感染。

### 研究的局限性与未来方向

尽管本研究取得了重要的进展，但也存在一些局限性。首先，研究中未对抗菌肽的蛋白水平进行直接检测，这可能影响对抗菌肽表达与抗菌效果之间关系的准确判断。其次，哈里斯粘液模型虽然在研究宿主-病原体相互作用方面具有一定的优势，但其相对简单，可能无法完全反映哺乳动物复杂的免疫反应。因此，在解释研究结果时，需要谨慎考虑这些因素。

未来的研究可以进一步探索益生菌在不同环境条件下的抗菌效果，包括在**厌氧环境**中的表现，因为肠道的不同区域可能存在不同的氧气水平。此外，还可以对益生菌的其他特性进行评估，如**酸和胆汁耐受性**、**表面疏水性**以及**对肠道上皮细胞的粘附能力**。这些特性可能影响益生菌在肠道中的存活和抗菌效果。同时，研究还应关注益生菌如何调控特定的抗菌肽，以更深入地理解其保护机制。

### 结论

本研究的结果表明，*L. acidophilus* 和 *L. gasseri* 在预防 ETEC 感染方面表现出显著的抗菌潜力，而 *L. reuteri* 在本实验条件下则未能发挥明显作用。这些益生菌菌株通过调节抗菌肽的表达，增强了宿主的免疫反应，从而有效控制了 ETEC 感染。然而，其抗菌效果与 ETEC 菌株的类型密切相关，因此在实际应用中，需要根据具体的病原体选择合适的益生菌菌株。

本研究不仅为寻找抗生素替代品提供了新的思路，也为未来开发基于益生菌的抗菌策略奠定了基础。通过进一步研究益生菌的分子机制及其在不同环境中的表现，可以更全面地了解其在肠道健康和疾病预防中的作用。这将有助于推动可持续的畜牧业发展，减少抗生素的使用，同时提高猪只的健康水平和生产性能。