卤醇脱卤酶催化动力学拆分新策略：高效对映选择性合成手性δ-卤代醇与四氢呋喃

《Communications Chemistry》：Biocatalytic kinetic resolution for efficient and enantioselective synthesis of δ-haloalcohols and tetrahydrofurans

本刊推荐：研究人员针对手性δ-卤代醇和四氢呋喃高效合成难题，开发了卤醇脱卤酶(HHDH)催化的动力学拆分新方法。该研究通过蛋白质工程获得高活性突变体HheC-QM1，实现了高达185 g/L底物浓度下的高效转化，获得>99% ee的光学纯度，为药物合成提供了绿色高效的生物催化方案。

　　

在药物合成和天然产物化学领域，手性δ-卤代醇和四氢呋喃作为关键结构单元备受关注。然而，传统化学合成方法往往面临对映选择性控制难、反应条件苛刻、环境污染大等挑战。特别是含有手性中心的δ-卤代醇，其不对称合成一直是有机合成领域的难点。生物催化因其高效、高选择性以及环境友好等优势，为手性化合物的合成提供了新思路。

卤醇脱卤酶(HHDH)是一类具有催化多样性的短链脱氢酶超家族成员，以往研究主要集中于其催化β-卤代醇的环氧化反应以及环氧化合物的开环反应。然而，该酶在δ-卤代醇转化方面的应用潜力尚未被充分挖掘。本研究团队设想：能否拓展HHDH的催化能力，开发一种新型的动力学拆分策略，实现对映选择性合成手性δ-卤代醇和四氢呋喃？

研究人员首先以外消旋4-氯-1-苯基丁醇(1a)为模型底物，对38种野生型HHDH进行了系统筛选。结果显示，来源于根癌农杆菌AD1的HheC野生型表现出59%的转化率和中等对映选择性(E=20)。随后通过对活性位点残基进行理性设计，获得了四重突变体HheC-QM1(P84V/F86P/T134A/N176A)，该突变体不仅催化活性显著提高，更展现出优异的R-对映选择性(E>200)，能够以92% ee获得剩余底物(S)-1a，以99% ee获得产物(R)-1b。

在底物适用性研究中，HheC-QM1对各类δ-卤代醇均表现出良好的催化性能。苯环上带有甲基、甲氧基、卤素等取代基的底物(2a-9a)都能顺利转化，以42-50%的分离收率和86->99% ee获得相应的手性四氢呋喃和δ-卤代醇。值得注意的是，该方法还能耐受萘环(11a)和噻吩(13a)等杂环底物，展现了广泛的底物适应性。

机制研究表明，HHDH催化δ-卤代醇环化遵循S_N2反应机制。催化三联体S132-Y145-R149、卤素结合位点(HBS)和R基团结合位点(RBS)共同调控底物的结合构象和反应对映选择性。分子对接分析显示，在HheC-QM1突变体中，(R)-1a的C-Cl键取向发生改变，与HBS区域内残基的氢键相互作用减弱，这可能解释了其催化效率提高的原因。

为实现对映互补合成，研究人员通过对P84、F86、T134等关键残基进行定点饱和突变，获得了S-对映选择性突变体HheC-SM11(F86W)。该突变体在20 mM底物浓度下实现48%转化率，以95% ee获得(S)-1b，以87% ee获得(R)-1a，成功实现了对映互补的动力学拆分。

在实际应用性评估中，该方法展现出优异的工业化潜力。即使在500 mM高底物浓度下，反应仍能保持45%的转化率。更令人印象深刻的是，在1 M(185 g/L)的极高底物浓度下，反应20小时后仍能顺利完成，获得48%收率、97% ee的(R)-1b和49%收率、95% ee的(S)-1a，对映选择性E值>200。

此外，研究人员还展示了手性δ-卤代醇的衍生化应用。通过叠氮化、氟化等反应，成功合成了多种具有生物活性的衍生物，如可用于点击化学的δ-叠氮醇(S)-1c、含手性C-F键的(R)-1d以及作为胶质瘤治疗候选药物中间体的(S)-1e等，凸显了该生物催化方法的合成应用价值。

关键技术方法包括：卤醇脱卤酶突变库构建与高通量筛选、蛋白质理性设计与定向进化、全细胞生物转化、手性HPLC/GC对映体纯度分析、分子对接与反应机制研究、公斤级规模制备工艺优化。

Screening of HHDHs

研究人员通过对38种野生型HHDH和17种HheC突变体的系统筛选，发现HheC-QM1四重突变体具有最优的R-对映选择性，其k_cat高达144.89 s^-1，K_m为0.34 mM。

Substrate scope for R-enantioselective dehalogenation ofδ-haloalcohols

HheC-QM1对各类芳香族、杂环和烷基取代的δ-卤代醇均表现出良好的催化活性和对映选择性，最高可获得>99% ee的光学纯度，但对α,α-二取代底物的对映选择性较低。

Mechanism analysis

通过分子对接和突变体分析，揭示了T134和N176等关键残基在调控酶活性和对映选择性中的重要作用，阐明了HBS和RBS区域如何协同控制底物结合构象。

Development of S-enantioselective enzyme

通过定点饱和突变获得S-对映选择性突变体HheC-SM11(F86W)，其K_m为1.74 mM，k_cat为1.91 s^-1，实现了对映互补的动力学拆分。

Substrate scope for S-enantioselective dehalogenation ofδ-haloalcohols

S-对映选择性酶对多数底物表现出中等到优异的对映选择性，但酶-底物配对存在特异性，不同突变体对特定底物表现出最佳催化性能。

Large-scale and transformation reactions

该方法在1 M超高底物浓度下仍保持优异性能，并成功应用于多种生物活性分子的合成，证明了其工业化应用潜力。

本研究成功拓展了HHDH的催化能力，建立了首个高效、高对映选择性的δ-卤代醇动力学拆分方法。该方法不仅解决了手性δ-卤代醇和四氢呋喃合成难题，更展示了生物催化在绿色制药中的巨大潜力。通过理性蛋白质工程和机制研究，为酶催化剂的定向改造提供了重要借鉴。该成果发表于《Communications Chemistry》，为手性化合物合成提供了新范式，有力推动了生物催化在药物合成中的应用进程。