CYP321A9参与两种二酰胺类杀虫剂——氯虫腈（chlorantraniliprole）和四氯氯虫腈（tetrachlorantraniliprole）在苹果蠹蛾（Spodoptera frugiperda）体内的代谢过程

《Pesticide Biochemistry and Physiology》：CYP321A9 mediates the metabolism of two diamide insecticides, chlorantraniliprole and tetrachlorantraniliprole in Spodoptera frugiperda

杀虫剂代谢与耐药性机制研究

　　本研究聚焦于草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）对二酰胺类杀虫剂的抗性问题，探讨了氯虫苯甲酰胺（CHL）和四氯虫苯甲酰胺（TET）对两种细胞色素P450基因SfCYP321A9和SfCYP6AE44表达的影响，并揭示了它们在杀虫剂代谢中的作用。草地贪夜蛾是一种极具破坏性的农业害虫，具有广泛的食性、强大的适应能力和快速的繁殖能力。其可取食超过350种植物，包括玉米、小麦、水稻、棉花以及各种水果和蔬菜，主要以叶片、茎秆和生殖器官为食。这种广泛的食性对全球作物生产构成了严重威胁，也显著阻碍了植物的正常生长。因此，如何有效控制该害虫的侵害，尤其是其对杀虫剂的抗性，已成为农业研究的重要课题。

二酰胺类杀虫剂因其高效性而被广泛使用，这类杀虫剂的主要作用机制是激活昆虫细胞中的烟碱型乙酰胆碱受体（RyR），从而引发过量钙离子释放，导致肌肉收缩障碍、麻痹，最终引发昆虫死亡。然而，随着这些杀虫剂的广泛应用，草地贪夜蛾对二酰胺类杀虫剂的抗性也在迅速发展。特别是氯虫苯甲酰胺（CHL）作为该类杀虫剂中最早成功商业化的产品之一，已被广泛应用于全球范围，成为控制鳞翅目害虫的重要手段。然而，长期依赖CHL导致了其在多个地区的快速抗性演化，尤其是在亚洲、美洲和非洲的田间种群中，CHL抗性水平已显著上升。为应对抗性挑战和扩大杀虫剂的适用范围，四氯虫苯甲酰胺（TET）作为一种新型的二酰胺衍生物被开发并引入市场，作为CHL的潜在替代品。然而，由于TET与CHL同属二酰胺类，其在CHL抗性种群中可能面临交叉抗性问题，这威胁到了其可持续应用的前景。

交叉抗性是指昆虫在对一种或多种化学结构相似的杀虫剂产生抗性时，通过共享的抗性机制实现的。由于CHL和TET的作用机制相似，草地贪夜蛾在接触其中一种后，可能会对两者都产生抗性。这可能与RyR的结构或功能变化有关，而RyR的变化可能导致对两种杀虫剂的抗性。此外，长期接触这两种杀虫剂可能进一步上调草地贪夜蛾的解毒酶活性，使其能够同时代谢并解毒两种杀虫剂。

细胞色素P450酶（P450s）在昆虫的生理和生化过程中发挥着重要作用，具有广泛的底物特异性。在昆虫体内，P450s主要承担两种功能：一方面，它们参与内源性化合物如蜕皮激素的合成与分解，维持昆虫的正常生理功能；另一方面，它们还参与外源性物质如杀虫剂和植物毒素的代谢，帮助昆虫进行解毒。P450介导的代谢过程通常会将脂溶性化合物转化为更易排泄的水溶性代谢产物，从而降低其毒性。P450基因家族在昆虫抗性机制中扮演着关键角色，例如，小菜蛾（Plutella xylostella）可能因CYP6BG1的过表达而对氯虫苯甲酰胺产生抗性。在其他多种鳞翅目害虫中，如草地螟（Spodoptera litura）、小地老虎（Spodoptera exigua）和棉铃虫（Helicoverpa armigera），不同植物次生代谢产物和杀虫剂的暴露会导致CYP6亚家族成员的显著上调。此外，在对氰虫苯甲酰胺产生抗性的棉蚜种群中，多个P450基因被发现过表达。通过RNAi和转基因果蝇的实验研究，CYP380C6被确认为对氰虫苯甲酰胺抗性的重要贡献者。同样，在棉铃虫中，CYP337B3与氯氰菊酯抗性相关。在草地贪夜蛾中，通过RNAi沉默CYP6AY1基因可增加其对氯虫苯甲酰胺的敏感性，表明该基因在抗性机制中的重要性。此外，CYP321A9基因在草地贪夜蛾中被确认为一种多功能的解毒酶，其在杀虫剂暴露后表达显著上调，并且在对多种合成杀虫剂的代谢中发挥重要作用。在相关物种如草地螟中，CYP321A9基因在中肠和脂肪体中高度表达，并且被多种植物化感物质强烈诱导，表明其在异源物质适应中的广泛作用。

本研究选择CHL和TET这两种具有代表性的二酰胺类杀虫剂，旨在探讨P450基因SfCYP321A9在草地贪夜蛾对二酰胺类杀虫剂代谢中的作用。通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）、RNA干扰（RNAi）、体外重组蛋白实验、液相色谱-高分辨质谱（LC-Q-TOF）分析以及分子对接等方法，系统研究了这两种杀虫剂对SfCYP321A9和SfCYP6AE44基因表达的影响。研究结果表明，这两种杀虫剂均显著上调了SfCYP321A9和SfCYP6AE44的表达，其中在中肠中观察到了最高的表达水平。RNA干扰导致的基因沉默显著降低了这两种杀虫剂的代谢速率，强调了这些基因在杀虫剂代谢中的关键作用。体外实验进一步证实了CYP321A9蛋白能够直接代谢CHL和TET，并通过代谢产物分析明确了相关的代谢途径和产物特征。分子对接则揭示了CYP321A9与这两种杀虫剂之间的特异性结合模式。这些发现提供了直接证据，证明SfCYP321A9在二酰胺类杀虫剂代谢中的作用，突显了其在草地贪夜蛾抗性机制中的重要性。

此外，本研究还探讨了CHL和TET在化学结构和结合特性上的关键差异。尽管两者都作用于RyR，但TET的结构中包含了四氯吡啶基团，而CHL则含有氯吡啶基团。这种结构上的差异可能影响它们与解毒酶如P450s的相互作用。在毒理学方面，研究表明TET可能在RyR上具有不同的结合位点或结合方式，这可能有助于克服某些由特定RyR突变引起的靶点抗性机制。因此，CHL和TET的组合为研究二酰胺类杀虫剂中代谢P450s在交叉抗性演化中的作用提供了理想的模型系统。

本研究不仅揭示了SfCYP321A9在杀虫剂代谢中的关键作用，还进一步探讨了其在不同器官中的表达模式。结果显示，SfCYP321A9和SfCYP6AE44在草地贪夜蛾体内表现出不同的组织特异性表达。通过对这两种基因的RNA干扰，研究发现它们的表达水平显著下降，进而导致杀虫剂代谢速率的降低。这些结果为理解草地贪夜蛾对二酰胺类杀虫剂的抗性机制提供了新的视角，也为制定更有效的害虫控制策略奠定了基础。

研究还发现，SfCYP321A9不仅在合成杀虫剂的代谢中发挥作用，还参与了多种植物化感物质的代谢过程。这种广泛的代谢能力使得SfCYP321A9成为一种重要的解毒酶，能够应对不同类型的环境压力。此外，SfCYP321A9的表达受到CncC信号通路的调控，这进一步说明了其在昆虫生理和抗性机制中的重要性。CncC/Maf的过表达能够诱导SfCYP321A9的表达，表明该基因的调控机制与昆虫的应激反应密切相关。

本研究通过综合多种实验方法，不仅验证了SfCYP321A9在杀虫剂代谢中的作用，还揭示了其在草地贪夜蛾抗性机制中的关键地位。这些发现有助于理解二酰胺类杀虫剂的抗性演化过程，并为未来开发新的杀虫剂和抗性管理策略提供了科学依据。同时，研究还强调了交叉抗性问题的重要性，这不仅影响了杀虫剂的使用效果，还对农业生产的可持续性构成了挑战。因此，深入研究草地贪夜蛾对二酰胺类杀虫剂的交叉抗性机制，对于确保全球粮食安全和推动可持续农业具有重要意义。

在实验设计方面，本研究使用了多种先进的技术手段，包括分子生物学、生物化学和计算生物学方法。首先，通过RT-qPCR技术检测了13种与抗性相关的P450基因在CHL和TET暴露后的表达水平。结果显示，SfCYP321A9的表达水平在两种杀虫剂处理后均显著上调，其中在CHL处理后的上调倍数最高，达到73.85倍，而在TET处理后则为21.74倍。这一结果表明，SfCYP321A9在二酰胺类杀虫剂的代谢中起着至关重要的作用。其次，通过RNA干扰技术，研究了SfCYP321A9和SfCYP6AE44基因的沉默对杀虫剂代谢的影响。结果表明，这些基因的沉默显著降低了杀虫剂的代谢速率，进一步验证了其在杀虫剂代谢中的关键作用。

此外，通过体外重组蛋白实验，研究了CYP321A9蛋白对CHL和TET的代谢能力。实验结果表明，CYP321A9能够直接代谢这两种杀虫剂，并且代谢产物分析进一步明确了其代谢途径和产物特征。这些结果为理解草地贪夜蛾对二酰胺类杀虫剂的代谢机制提供了直接证据。同时，分子对接技术的应用揭示了CYP321A9与CHL和TET之间的特异性结合模式，这有助于理解其代谢过程的分子基础。

本研究的发现不仅对草地贪夜蛾的抗性机制具有重要意义，也为其他昆虫的抗性研究提供了参考。SfCYP321A9作为多功能的解毒酶，其在多种杀虫剂和植物化感物质的代谢中均表现出显著的活性。这表明，P450基因在昆虫的应激反应和抗性演化中具有广泛的应用价值。同时，本研究还揭示了SfCYP321A9在不同器官中的表达模式，这有助于进一步理解其在昆虫体内的功能定位和代谢作用。

在农业应用方面，本研究的结果为开发更有效的杀虫剂和抗性管理策略提供了科学依据。由于草地贪夜蛾对二酰胺类杀虫剂的抗性迅速发展，研究其代谢机制有助于预测和应对抗性演化趋势。此外，本研究还强调了交叉抗性问题的重要性，这不仅影响了杀虫剂的使用效果，还对农业生产的可持续性构成了挑战。因此，深入研究草地贪夜蛾对二酰胺类杀虫剂的交叉抗性机制，对于确保全球粮食安全和推动可持续农业具有重要意义。

在技术方法上，本研究综合应用了多种先进的实验技术，包括分子生物学、生物化学和计算生物学方法。这些技术手段不仅提高了研究的准确性和可靠性，还为理解杀虫剂代谢的分子机制提供了新的视角。通过RT-qPCR技术，研究了P450基因的表达水平变化；通过RNA干扰技术，验证了这些基因在杀虫剂代谢中的功能；通过体外重组蛋白实验，直接观察了CYP321A9蛋白对杀虫剂的代谢能力；通过LC-Q-TOF分析，对代谢产物进行了高精度的定量分析；通过分子对接技术，揭示了CYP321A9与杀虫剂之间的结合模式。这些方法的综合应用，为研究杀虫剂代谢机制提供了全面的技术支持。

在实验结果的分析方面，本研究不仅关注了基因表达的变化，还探讨了其在不同组织中的表达模式。这种组织特异性表达模式为理解杀虫剂代谢的区域性特征提供了重要依据。同时，研究还揭示了基因表达变化与杀虫剂代谢之间的关系，表明基因表达的上调与代谢能力的增强密切相关。这些结果进一步支持了P450基因在昆虫抗性机制中的重要性，并为未来的抗性研究提供了新的思路。

本研究还强调了交叉抗性问题的紧迫性，这不仅影响了杀虫剂的使用效果，还对农业生产的可持续性构成了挑战。因此，研究草地贪夜蛾对二酰胺类杀虫剂的交叉抗性机制，对于制定有效的抗性管理策略具有重要意义。同时，本研究的结果也为其他昆虫的抗性研究提供了参考，特别是在理解P450基因在杀虫剂代谢中的作用方面。

综上所述，本研究通过系统的方法，揭示了SfCYP321A9和SfCYP6AE44在草地贪夜蛾对二酰胺类杀虫剂代谢中的关键作用。这些发现不仅有助于理解草地贪夜蛾的抗性机制，还为开发更有效的杀虫剂和抗性管理策略提供了科学依据。同时，研究还强调了交叉抗性问题的重要性，这不仅影响了杀虫剂的使用效果，还对农业生产的可持续性构成了挑战。因此，深入研究草地贪夜蛾对二酰胺类杀虫剂的交叉抗性机制，对于确保全球粮食安全和推动可持续农业具有重要意义。