单细胞分辨率图谱揭示了中草药地榆根（Sanguisorbae Radix）所诱导的免疫调节机制

《Phytomedicine》：Single-Cell Resolution Mapping of the Immune Modulation Landscape Induced by Chinese Herb Sanguisorbae Radix

SR通过单细胞转录组测序分析影响人类外周血单核细胞免疫细胞比例及活性，发现增强细胞毒性T细胞（提升LYZ、GZMK基因表达）并抑制炎症相关基因及NF-κB通路（P65、IκB磷酸化降低），同时鉴定21种化学成分（UPLC-MS/MS）并分析其潜在靶点。

　　在本研究中，我们探讨了“茜草根”（Sanguisorbae radix，SR）对人体免疫系统的影响，特别是其在单细胞水平上的免疫调节作用。SR作为一种传统中药，被广泛用于增强免疫功能，其作用机制主要与提高巨核细胞/血小板的比例有关。然而，SR对不同类型的免疫细胞的具体影响和潜在机制仍需进一步深入研究。本研究通过单细胞转录组测序（scRNA-seq）技术，对同一批受试者在服用SR前后的外周血单个核细胞（PBMCs）进行分析，从而揭示SR在免疫调节方面的整体作用。此外，我们还通过逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）和蛋白质印迹（Western blotting）等实验手段，对SR的生物效应进行了验证。为了更全面地了解SR的化学成分及其可能的分子靶点，我们还使用了超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）技术进行成分鉴定，并通过分子对接分析其潜在作用靶点。

研究结果显示，除了巨核细胞/血小板外，SR的摄入还导致了其他免疫细胞比例的变化。具体而言，DCs（树突状细胞）、NK细胞（自然杀伤细胞）、CD8+ T细胞和Na?ve CD4+ T细胞的比例显著增加，而Mast细胞（肥大细胞）、B细胞和单核细胞的比例则有所下降。值得注意的是，SR的摄入可能增强了CD8+ T细胞的细胞毒性功能，这表现在细胞毒性评分的提高以及与细胞毒性效应分子（如LYZ和GZMK）相关的基因表达水平的上调。此外，SR还上调了与核糖体和线粒体相关的基因表达，并抑制了T细胞、单核细胞和巨核细胞/血小板中的炎症相关基因的表达。研究进一步发现，SR可能通过增加LC3-II的表达和减少SQSTM1的水平，促进线粒体自噬（mitophagy）的激活。同时，SR还能通过抑制P65和IκB的磷酸化，从而抑制NF-κB信号通路的激活。

在化学成分分析方面，通过UPLC-MS/MS技术鉴定出SR中含有21种主要成分，这些成分可能与scRNA-seq分析中发现的枢纽基因存在潜在的结合关系。这表明SR的免疫调节作用不仅依赖于其对免疫细胞数量的调节，还可能涉及其活性成分对特定基因的调控，从而影响细胞功能和信号通路。这些发现为进一步揭示SR在免疫调节中的作用机制提供了重要线索，并为开发基于传统中药的免疫调节治疗药物提供了理论依据。

SR作为传统中药，具有悠久的应用历史，被广泛用于治疗多种炎症和代谢性疾病，如出血性疾病、胃肠道炎症、糖尿病、白细胞减少症和热损伤等。近年来，越来越多的研究表明，SR提取物或单体具有止血、抗炎、抗菌、抗病毒、抗过敏、抗肥胖、抗肿瘤、神经保护和肝保护等多种药理作用。其中，抗炎、抗菌、抗过敏和抗肿瘤等特性与免疫调节密切相关。例如，有研究发现，从SR中提取的多糖能够显著抑制小鼠肿瘤的生长，并增强免疫功能，表现为脾脏指数的增加、脾细胞的增殖以及血清中IL-2、TNF-α和IFN-γ水平的提升。此外，SR提取物还能通过阻断PD-1和PDL-1的结合，抑制结肠癌细胞的生长，并且当SR提取物与抗PD1抗体联合使用时，能够产生更强的免疫肿瘤治疗效果。另外，有研究证实，SR提取物能够通过抑制PI3K-AKT、NF-κB和STAT3等信号通路，减轻小鼠的结肠炎症状。

尽管SR在免疫调节方面表现出多种潜在作用，但其对人类免疫细胞的具体作用机制仍需进一步研究。因此，本研究首次在单细胞水平上，对SR对人体免疫细胞的调控作用进行了系统分析。通过scRNA-seq技术，我们获取了4名受试者在服用SR前后PBMCs的转录组数据，总共获得了204,882个细胞和32个细胞簇。t-SNE图谱显示了32个细胞簇，涵盖了12种免疫细胞类型，包括3种T细胞亚型、2种单核细胞亚型、3种B细胞亚型、NK细胞和DCs。通过对这些数据的整合分析，我们不仅揭示了SR对免疫细胞比例的影响，还进一步发现了其对免疫细胞功能的调控作用。

在研究过程中，我们首先通过scRNA-seq技术获取了SR摄入前后PBMCs的转录组数据，随后利用生物信息学方法对这些数据进行了深入分析。研究结果表明，SR的摄入可能导致了多种免疫细胞类型的转录变化，包括某些细胞类型的基因表达水平的上调或下调。此外，SR的摄入还可能影响了免疫细胞的功能状态，如增强某些细胞的活性或抑制某些细胞的炎症反应。这些发现为进一步阐明SR在免疫调节中的作用机制提供了重要的实验依据。

在对SR的免疫调节作用进行深入研究的同时，我们还对其化学成分进行了分析。通过UPLC-MS/MS技术，我们鉴定出SR中含有21种主要成分，这些成分可能与scRNA-seq分析中发现的枢纽基因存在潜在的相互作用。这表明SR的免疫调节作用可能不仅仅局限于其对免疫细胞数量的调节，还可能涉及其活性成分对特定基因的调控，从而影响细胞功能和信号通路。因此，SR的免疫调节作用可能是多方面的，涉及其对多种免疫细胞类型的调控，以及其活性成分对特定分子靶点的结合。

在实验设计方面，本研究严格遵循伦理规范，所有实验均符合赫尔辛基宣言的要求，并获得了所有参与者的知情同意。研究方案也经过了伦理委员会的审批，确保了实验的合法性和伦理性。此外，我们还对实验材料进行了详细的描述，SR的提取物由成都中医药大学附属医院提供，血样采集工作则在成都中医药大学附属医院完成。这些实验材料的来源和处理过程均符合相关标准，确保了实验的可重复性和数据的可靠性。

本研究的发现对于理解SR在免疫调节中的作用具有重要意义。首先，SR可能通过调节免疫细胞的比例，影响人体免疫系统的整体功能。其次，SR可能通过增强某些免疫细胞的活性，如CD8+ T细胞的细胞毒性功能，从而发挥免疫增强作用。此外，SR可能通过抑制某些炎症相关基因的表达，减少炎症反应，从而发挥抗炎作用。这些发现不仅为SR的药理作用提供了新的视角，也为开发基于传统中药的免疫调节药物提供了理论支持。

综上所述，本研究首次在单细胞水平上揭示了SR对人体免疫细胞的调控作用，包括其对免疫细胞比例和功能的影响。通过整合scRNA-seq数据，我们不仅发现了SR对免疫细胞的总体影响，还进一步揭示了其对不同细胞类型的特定作用。这些发现为进一步研究SR的免疫调节机制提供了重要的实验依据，并为开发基于传统中药的免疫调节药物提供了新的思路。此外，SR的化学成分分析也为理解其药理作用提供了分子层面的支持，表明其活性成分可能通过与特定基因的结合，影响免疫细胞的功能和信号通路。因此，SR的免疫调节作用可能是多方面的，涉及其对多种免疫细胞类型的调控，以及其活性成分对特定分子靶点的结合。这些研究结果不仅有助于深入理解SR的药理作用，也为传统中药在免疫调节领域的应用提供了新的方向。