N-乙酰半胱氨酸酰胺通过保护线粒体和重编程血管内皮细胞的能量代谢来缓解病理性新生血管形成

《Redox Biology》：N-acetylcysteine amide alleviates pathological neovascularization through mitochondrial protection and energy metabolism reprogramming of vascular endothelial cells

线粒体稳态和能量代谢调节是NACA抑制氧诱导视网膜病变中病理新生血管形成的关键机制，同时NACA通过减少活性氧和改善线粒体功能保护内层视网膜神经元，且具有良好安全性。

　　### 研究背景与意义

病理性的血管新生是多种疾病的重要病理特征，其影响范围广泛，从新生儿到老年人，涉及多个年龄段的疾病，如早产儿视网膜病变（ROP）、年龄相关性黄斑变性（AMD）、癌症以及增殖性糖尿病视网膜病变（PDR）等。这些疾病给全球数以百万计的人群带来了严重的健康挑战，且其治疗手段仍存在诸多局限。目前，针对血管新生的主流治疗方法是通过反复注射抗血管内皮生长因子（VEGF）药物来抑制异常的血管生成。然而，这种治疗方式伴随着一系列不良反应，例如注射频率高、药物耐受性差，这些因素限制了其长期应用。此外，由于病理血管新生机制复杂，传统的抗VEGF治疗往往无法全面覆盖所有相关分子和信号通路，导致部分患者疗效不佳。

因此，探索新的治疗策略成为亟需解决的问题。研究表明，血管内皮细胞（VECs）在缺氧环境下会激活一系列基因和蛋白，从而促进血管的生长和扩张。这些过程不仅依赖于VEGF的下游效应，还与细胞内的能量代谢和线粒体功能密切相关。线粒体作为细胞的能量工厂，其功能状态直接影响到VECs的生理活动和病理变化。例如，线粒体功能障碍会导致线粒体活性氧（mtROS）水平升高，而mtROS可以进一步激活多种下游信号通路，加剧血管新生的病理过程。同时，线粒体的氧化磷酸化（OXPHOS）在正常细胞代谢中起着关键作用，其功能增强可能有助于抑制病理性的血管新生。

基于这些发现，研究人员开始关注线粒体调控机制在血管新生中的作用，并试图寻找能够有效调节线粒体功能的药物。N-乙酰半胱氨酸（NAC）作为一种含硫抗氧化剂，已被广泛用于临床治疗与氧化应激相关的疾病。然而，NAC存在生物利用度低、半衰期短等缺点，限制了其在某些疾病中的应用效果。为此，研究者设计并合成了一系列脂溶性硫醇化合物，其中NACA（N-乙酰半胱氨酸酰胺）因其良好的脂溶性、膜渗透性和生物利用度，被认为是一种具有潜力的新型药物。

### NACA的生物学特性与作用机制

NACA作为NAC的衍生物，其分子结构中包含一个中性羧基，这使得它比NAC更具脂溶性，从而更容易穿透细胞膜并进入细胞内。其主要作用机制包括：通过增强细胞内谷胱甘肽（GSH）水平，NACA能够有效清除活性氧（ROS），维持细胞的氧化还原平衡。此外，NACA还能通过调节线粒体的融合与分裂过程，恢复线粒体的结构和功能，从而抑制线粒体功能障碍所引发的血管新生。

在细胞层面，NACA对血管内皮细胞的抗血管生成作用主要体现在抑制其增殖、迁移和管状结构形成的能力上。通过细胞活力实验（如CCK-8）、迁移实验（如划痕实验）以及管状形成实验，研究人员发现NACA在缺氧条件下能够显著减少血管内皮细胞的活性和迁移能力，从而抑制异常的血管生成。此外，NACA还能通过恢复线粒体的氧化磷酸化功能，改善细胞的能量代谢状态，减少线粒体活性氧的积累，进而发挥其抗血管生成的效应。

### 实验方法与结果分析

为了验证NACA的抗血管生成和线粒体保护作用，研究团队采用了一系列实验方法，包括细胞培养、动物模型建立、免疫荧光染色、透射电镜（TEM）观察、线粒体功能检测（如OCR和ECAR实验）以及基因表达分析（如smart RNA-seq和GO/KEGG分析）。在细胞实验中，研究人员发现NACA在较低浓度下即可有效抑制缺氧诱导的血管内皮细胞的异常行为，同时不会显著影响细胞的正常生理功能。这些结果表明，NACA在细胞水平上具有良好的安全性和有效性。

在动物实验中，研究人员利用氧诱导视网膜病变（OIR）模型，观察NACA对病理血管新生的抑制作用。OIR模型是研究血管新生的重要工具，其原理是通过在新生小鼠中建立缺氧环境，模拟人类病理血管新生的过程。实验结果显示，NACA能够显著减少OIR模型中的血管新生区域，并且促进缺血区域的再血管化。通过免疫荧光染色，研究人员观察到NACA治疗后，血管内皮细胞的活性显著降低，同时内层视网膜神经元的损失也得到了有效缓解。这些结果进一步证明了NACA在抑制病理血管新生和保护神经元方面的双重作用。

此外，研究人员还通过透射电镜观察了NACA对线粒体结构的影响。结果表明，NACA能够有效修复缺氧导致的线粒体形态学损伤，恢复其正常的形态和功能。线粒体的形态学变化，如线粒体数量减少、形态异常等，是缺氧诱导的血管新生的重要标志之一。通过分析线粒体的形态参数，如线粒体的形状因子（FF）、分支数量和末端数量，研究人员发现NACA能够显著改善这些参数，从而恢复线粒体的结构完整性。

在基因表达层面，通过smart RNA-seq技术，研究人员对OIR模型中的血管内皮细胞进行了全转录组分析。结果显示，NACA能够显著下调与缺氧相关的基因表达，同时上调与线粒体氧化磷酸化相关的基因。这一发现不仅揭示了NACA的抗血管生成机制，还为未来的药物开发提供了新的思路。通过GO和KEGG分析，研究人员进一步确认了NACA对线粒体蛋白合成、ATP合成以及线粒体呼吸链活动的增强作用，表明其对线粒体功能的全面修复。

### NACA的抗血管生成与线粒体保护作用的验证

为了进一步验证NACA的作用机制，研究人员采用了多种实验手段。例如，通过OCR和ECAR实验，研究人员评估了NACA对线粒体能量代谢的影响。结果显示，NACA能够显著恢复线粒体的氧化磷酸化功能，增强细胞的ATP合成能力，从而改善细胞的能量供应。同时，NACA并未显著影响细胞的糖酵解活性，表明其主要作用是通过恢复线粒体功能来发挥抗血管生成作用。

此外，研究人员还通过使用寡霉素（oligomycin）对NACA的作用进行了验证。寡霉素是一种ATP合成酶抑制剂，能够阻断线粒体的氧化磷酸化过程。实验结果显示，当使用寡霉素阻断NACA的作用时，其抗血管生成效果被部分削弱，这进一步证实了NACA的作用机制与线粒体功能的恢复密切相关。

在神经保护方面，NACA能够有效减少缺血区域的神经元损失，包括视网膜神经节细胞（RGCs）、无长突细胞（ACs）、水平细胞（HCs）和双极细胞（BCs）。这些细胞的损失是缺氧和缺血性视网膜病变的重要特征，而NACA的治疗显著改善了这些细胞的存活率。通过免疫荧光染色和组织切片分析，研究人员发现NACA能够有效减少血管渗漏，并恢复血管内皮细胞的连接完整性，从而改善视网膜的微环境。

### NACA的安全性评估

在安全性方面，研究人员对NACA进行了详细的评估。首先，在细胞实验中，NACA在低浓度下（低于20 mM）未表现出明显的细胞毒性，表明其在治疗剂量范围内对血管内皮细胞是安全的。其次，在动物实验中，NACA通过玻璃体注射方式施用，未引起视网膜血管或神经元的明显损伤。通过H&E染色和组织切片分析，研究人员发现NACA在主要器官（如心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）中未表现出明显的毒性效应，进一步支持了其良好的安全性和广泛的生物分布能力。

此外，NACA具有良好的血脑屏障（BBB）穿透性，这意味着其可以通过血液系统分布到全身，而不仅仅是局部作用。这种特性使得NACA在治疗某些全身性血管疾病时具有更大的应用潜力。然而，考虑到视网膜的复杂结构和血视网膜屏障（BRB）的存在，研究人员特别关注了NACA在视网膜各层中的分布情况。结果表明，NACA能够有效渗透到视网膜的各个层次，包括内层和外层神经元，从而发挥其广泛的保护作用。

### NACA的临床应用前景

综上所述，NACA作为一种新型的抗氧化剂，不仅能够有效抑制病理性的血管新生，还能通过恢复线粒体功能和能量代谢，保护视网膜神经元。这些作用机制表明，NACA在治疗多种与血管新生相关的疾病方面具有广阔的应用前景。特别是在眼科疾病领域，NACA的抗血管生成和神经保护作用使其成为一种具有潜力的治疗药物。

从临床应用的角度来看，NACA具有较高的生物利用度和良好的安全性，这为其在临床试验中的应用提供了基础。然而，为了进一步提高其临床转化的可能性，研究团队还提出了多个未来的研究方向。例如，开发更便捷的给药方式，如眼药水或口服制剂，以减少玻璃体注射的侵入性。此外，进一步研究NACA在其他病理血管新生模型中的效果，有助于确认其治疗的广泛适用性。同时，结合单细胞测序和蛋白质组学等先进技术，可以更深入地了解NACA的多靶点作用机制，从而优化其治疗效果。

### 研究的启示与展望

本研究不仅揭示了NACA在抑制病理血管新生和保护视网膜神经元方面的双重作用，还为未来的药物开发提供了新的思路。NACA通过恢复线粒体功能和能量代谢，能够有效干预血管新生的病理过程，而其良好的安全性和广泛的生物分布能力，使其在临床应用中具有较大的优势。此外，NACA的作用机制涉及多个层面，包括抗氧化、抗炎、抗凋亡以及调节细胞代谢等，这表明其可能成为一种多靶点治疗药物。

在未来的研究中，可以进一步探索NACA在不同疾病模型中的应用效果，以及其与其他治疗手段的联合使用潜力。同时，研究其在不同年龄段人群中的疗效差异，有助于优化治疗方案。此外，开发新型的给药方式，如可生物降解的缓释系统或非侵入性的给药途径，也将是提升NACA临床应用价值的重要方向。通过这些努力，NACA有望成为一种安全、有效的新型治疗药物，为多种与血管新生相关的疾病提供新的治疗选择。