从红脉蜻蜓（Sympetrum fonscolombii）肠道中发现并鉴定出能够降解聚丙烯酸尿烷的新细菌

《Science of The Total Environment》：Discovery and characterization of novel polyacrylic urethane-degrading bacteria from intestine of the red-veined darter ( Sympetrum fonscolombii)

本研究从红蜻蜓肠道中分离出Serratia sp. IBT73和Pseudomonas sp. IBT82两种细菌，证实其可降解聚丙烯酸聚氨酯（PAU）。通过转录组分析发现IBT73激活小分子代谢通路，IBT82则增强应激反应。酶学实验表明两种菌株的酯酶对PAU降解率达73%-89%，FTIR和GC-MS证实了酯键和脲键的断裂，以及代谢产物的生成。该发现为PU塑料的微生物降解提供了新菌种资源。

　　塑料废弃物的累积对环境和社会经济构成了重大挑战，主要归因于塑料的固有降解阻力。在众多塑料中，聚氨酯（PU）因其广泛应用而尤为突出，同时因其降解难度大而成为研究的热点。本研究中，我们从红脉蜻蜓（*Sympetrum fonscolombii*）肠道中分离并表征了两种细菌菌株——*Serratia* sp. IBT73 和 *Pseudomonas* sp. IBT82，它们具有降解聚丙烯酸酯（PAU）的潜力。通过检测和纯化这些菌株的胞外酯酶、尿酶和蛋白酶活性，我们发现它们能够有效降解PAU。使用扫描电子显微镜（SEM）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）以及降解产物的化学分析，全面验证了PU材料的生物降解过程。定量分析显示，菌株IBT73和IBT82分别对PS-PU和PE-PU泡沫的降解率达到10.05%和6.81%、3.23%和4.33%。而纯化的酯酶在48小时内对PAU悬浮液的降解能力高达89.76%和73.21%。转录组分析揭示了两种菌株在PAU暴露下的不同转录响应：IBT73增强了小分子代谢途径，而IBT82则激活了应激反应途径。结构分析和代谢物鉴定表明，尿烷、酯和芳香结构被裂解，支持了微生物对PU的主动降解。这些发现突显了昆虫肠道微生物在降解化学结构多样化的PU材料方面的广泛潜力，为可持续的PU废弃物管理提供了新的视角。

在塑料生物降解领域，各种微生物，如细菌和真菌，被广泛用于降解塑料材料。对于PU，已有多种微生物被发现能够有效分解这种塑料。例如，真菌*Aspergillus tubingensis*通过靶向PU的酯和尿烷键分解PU，而菌株*Pseudomonas protegens* Pf-5则能够降解PU涂层。*Pseudomonas aeruginosa* 被发现可以降解PU二醇，而Shah等人证实其可以使用聚酯基（PS）-PU作为唯一的碳源。尽管细菌降解PU已有大量研究，大多数研究集中于PS-PU和聚醚基（PE）-PU，而对聚丙烯酸酯基PU（PAU）的微生物降解研究仍显不足。PAU是一种通过化学键将PU段与聚丙烯酸酯链结合的混合树脂系统，其结构旨在克服其他PU混合物的固有权衡。例如，PE-PU提供了高弹性和水解稳定性，但其对紫外线和氧化降解的抵抗力较差；而PS-PU则表现出优越的机械强度和溶剂抵抗力，但容易受到水解裂解的影响。PAU涂层结合了两种材料的优点，即尿烷段的机械耐用性和丙烯酸酯组分的高光学清晰度和耐候性。然而，从生物降解的角度来看，这些系统之间存在显著差异。PS-PU最容易受到微生物酶的降解，因为其酯键容易被酯酶和脂肪酶等常见酶水解。相比之下，PE-PU由于其稳定的醚键而表现出更高的抗性，不易被微生物酶裂解。PAU则表现出比PS-PU更高的耐性，其丙烯酸酯主链对生物降解固有抵抗。因此，虽然PAU在耐用性和耐候性方面具有显著优势，但其在微生物降解方面的表现却无特别之处。

随着对塑料生物降解的兴趣增加，研究利用昆虫肠道微生物进行塑料降解的科学和技术正在逐步展开。在人类活动日益影响的环境中，昆虫表现出重要的生态适应性，包括使用塑料作为筑巢材料、保护和碳源。例如，大蜡蛾（*Galleria mellonella*）已被发现能够消耗和降解PE，而黄粉虫（*Tenebrio molitor*）的肠道细菌也展示了对PE和PS的降解能力。此外，我们之前的研究表明，从* Xylocopa appendiculata*中分离出的* Xanthomonas* sp. 和从* Hierodula patellifera*中分离出的*Serratia* sp. 也具备PU降解能力，其中后者在14天内对PS-PU和PE-PU的降解率分别为20.34%和5.13%。PU的生物降解主要归功于这些微生物所产生的酶催化活性。已知的PU降解微生物来源的酶包括酯酶、脂肪酶、蛋白酶和尿酶。酯酶和脂肪酶可以水解PU软段中的酯键，如聚醚中的酯键。蛋白酶则可以水解尿烷和肽键，作用于由异氰酸酯衍生的硬段，而尿酶负责分解尿素键。

本研究引入了*Serratia* sp. IBT73和*Pseudomonas* sp. IBT82，这两种细菌具有降解PAU的潜力，是从红脉蜻蜓肠道中分离出的。我们研究了这两种菌株对其他类型PU的降解能力，并旨在确定它们在降解过程中的具体作用。为了进一步阐明所涉及的酶促机制，我们采用了转录组分析结合异源表达的方法。

在材料方面，我们购买了商业PAU清漆（acryl PU-Siegel，Düfa，Bad Kreuznach，Germany）以评估PAU的生物降解情况。该材料是一种商业水性分散的PAU杂化树脂，根据制造商的规格，包含30–40 wt%的PAU杂化树脂，分散在水（60–70 wt%）中，并补充了共溶剂（如甘醇、醇类，1–5 wt%）、功能性添加剂（如消泡剂、流变修饰剂，<1 wt%）、紫外线稳定剂（<1 wt%）和生物杀灭剂（如2-甲基-2H-异噻唑-3-酮，<0.1 wt%）。PS-PU和PE-PU泡沫则从KPX Chemical Co.（Seoul，Republic of Korea）购买。每种PU泡沫被切割成小块（PS-PU，20×10×10 mm；PE-PU，20×20×5 mm），并称重为80 mg。泡沫被浸泡在70%乙醇中过夜，并用无菌蒸馏水洗涤。随后，这些块被放置在干燥烘箱中，在50°C下去除残留水分。

在筛选、分离和鉴定PAU降解细菌方面，我们从红脉蜻蜓（*Sympetrum fonscolombii*）的肠道中收集了样本。首先，用70%（v/v）乙醇清洗昆虫以去除表面污染物，然后用无菌水冲洗两次。在表面灭菌后，分离肠道并仔细回收肠道内容物。肠道内容物被稀释在磷酸盐缓冲盐水中，并涂布在含有1%（v/v）acryl PU-Siegel的1/5强度的R2A琼脂上，以分离PAU降解的肠道细菌。在30°C下培养48小时后，我们选择了两个菌株IBT73和IBT82，因为它们在生长区域周围形成了透明的环，表明其具有PAU降解活性。这些菌株在30°C下培养18小时，摇速为180 rpm。培养结束后，使用标准酚-氯仿方法从细胞沉淀中提取基因组DNA，包括细胞裂解、酚-氯仿-异戊醇提取以及乙醇沉淀核酸。通过PCR扩增16S rRNA基因，使用通用引物27F和1492R。PCR扩增在25 μL反应体积中进行，采用KOD Multi & Epi DNA聚合酶，热循环程序包括初始变性（95°C，5分钟），随后进行30个循环（95°C，30秒；55°C，30秒；68°C，90秒），以及最终延伸步骤（68°C，5分钟）。扩增的16S rRNA基因序列用于系统发育鉴定。从NCBI数据库中检索到的密切相关16S rRNA序列使用CLUSTAL X进行比对。使用MEGA X软件的邻接法推断16S rRNA基因的分子系统发育，通过1000次重复的靴带分析评估构建的系统发育树的统计可靠性。

在检测胞外酶活性方面，我们依据Bhagobaty和Joshi的方法（2012年）进行了轻微修改。在R2A琼脂上划线培养活性菌株，并加入每种测试的特定底物，然后在30°C下培养3天。通过观察培养基上的透明环来确认蛋白酶的产生，这些环出现在含有2%（w/v）脱脂乳的R2A琼脂上。胞外酯酶活性通过含有1%（w/v）吐温80和0.01%（w/v）CaCl2的R2A琼脂进行检测，通过观察培养基周围的猩红色点来确认酯酶活性。尿酶活性通过含有2克尿素、1克蛋白胨、1克葡萄糖、5克NaCl、2克K2HPO4、0.012克酚红、15克琼脂和1升水的琼脂板进行评估，按照Christensen的方法（1946年）制备。尿酶活性的正向指示是颜色从黄色变为粉红色，反映pH值的升高。

在评估PU泡沫的降解潜力方面，我们考察了菌株IBT73和IBT82对PS-PU和PE-PU泡沫的降解能力。称重为80±1 mg的PS和PE-PU泡沫块被加入带有100 mL 1/5强度R2A培养基的 baffled Erlenmeyer 烧瓶中。处于对数生长期的菌株悬浮液被调整为OD600为0.1（约107 CFU/mL），并加入每个烧瓶中。烧瓶在30°C下摇动（180 rpm）培养两周。为了监测非生物变化，设置了一个不含菌株的阴性对照烧瓶，与实验组在相同条件下培养。培养结束后，泡沫样品被从烧瓶中取出。为了去除附着的生物膜，样品首先用1%（w/v）SDS溶液洗涤，随后用蒸馏水彻底冲洗。最后，清洁后的泡沫在50°C的烘箱中干燥至恒定重量。使用以下公式计算每个泡沫样品的重量损失百分比：重量损失（%）= [(初始重量 - 最终重量)/初始重量] × 100。所有实验均在相同条件下进行三次重复。

通过扫描电子显微镜（SEM）观察PU泡沫在生物降解后的表面形态变化。样品被安装并用金涂层进行处理，使用sputter coater（Q15ORS，Quorum，East Sussex，UK）。使用FEI Quanta 250 FEG扫描电子显微镜（FEI，Hillsboro，OR，USA）进行成像。为了比较形态变化，也对未接种的PU泡沫进行了SEM观察。

为了研究菌株IBT73和IBT82在PAU暴露下的转录响应，我们进行了RNA测序和转录分析。菌株在含有1%（v/v）acryl PU-Siegel的1/5强度R2A培养基中培养3天。在暴露于PAU后，菌株细胞通过离心（10,000 × g，10分钟，4°C）收集，用于后续的转录分析。使用Qiazol裂解试剂（Qiagen，Germany）根据制造商协议提取总RNA。测序在Illumina NovaSeq 6000平台上进行，生成配对端读数。使用bcl2fastq2（版本2.20）进行碱基调用，生成的FASTQ文件使用ASCII Qscore偏移量33进行编码。RNA的质量和完整性通过Agilent 2100 Bioanalyzer进行评估。使用TruSeq Stranded Total RNA with Ribo-Zero Plus试剂盒（Illumina）去除rRNA并构建链特异性文库。所有RNA测序下游分析均在R（v4.2.0）中进行。差异表达基因（DEG）分析结果作为后续可视化和功能富集步骤的基础。使用Enhanced Volcano包生成火山图，以可视化基于log2倍数变化和调整后的p值的DEG分布。使用ggplot2包构建选定基因集的点图，以突出表达趋势和富集分数。为了进行基因本体（GO）注释，首先从UniProt获取基因到GO的映射。这些映射用于构建特定物种的注释包，使用AnnotationForge包。GO富集分析使用clusterProfiler包进行。同时应用了过表示分析和基因集富集分析（GSEA）。对于GSEA，基因根据DEG分析中的log2倍数变化值进行排序，以评估其在整个基因集中的富集趋势。

在鉴定和表征PAU降解酶方面，由于新分离菌株的全基因组序列尚未公布，我们采用同源策略来识别和扩增可能的酯酶编码基因。基于16S rRNA测序的系统发育鉴定后，使用公开的最密切相关物种——*S. marcescens*和*P. protegens*的基因组作为参考。从这些参考物种中检索已知的PU酯酶蛋白序列。使用Clustal Omega算法（https://www.ebi.ac.uk/jdispatcher/）进行多序列比对，以识别适合引物设计的高度保守区域。根据该比对结果，设计引物以特异性扩增IBT73和IBT82的同源酯酶基因。从IBT73和IBT82菌株中提取的基因组DNA作为模板，通过PCR（热循环器，Takara，Kyoto，Japan）扩增具有PAU降解能力的酯酶编码基因。对于IBT73，使用特定引物SML-F和SML-R进行基因扩增。对于IBT82，使用PYL-F和PYL-R进行基因扩增。为了便于Gibson组装，通过重叠延伸PCR重新扩增基因，使用包含与线性化末端同源的引物。对于IBT73，使用引物5′-GTGGTGGTGGTGGTGGTGCAGCGTGACCTGGCTG-3′（正向）和5′-GGACAGCAAATGGGTCGCATGGGCATCTTTAGC-3′（反向）进行重叠PCR。对于IBT82，使用引物5′-GTGGTGGTGGTGGTGGTGGGCGCCGGCTCGACAT-3′（正向）和5′-GGACAGCAAATGGGTCGCATGCCGTATCAAAC-3′（反向）进行重叠PCR。同时，使用设计生成与插入兼容的末端的引物线性化pET-28a(+)载体。通过NEBuilder? HiFi DNA Assembly Master Mix（New England Biolabs，USA）按照制造商的说明进行组装。组装后的构建体随后转化入*Escherichia coli* BL21 (DE3)。通过BLASTp搜索GenBank数据库，获取菌株IBT73和IBT82的酯酶氨基酸序列。使用Jalview（版本2.11.4）中实现的Clustal算法进行多序列比对。应用默认参数，并在Jalview界面中可视化和手动检查比对结果。使用MEGA X进行序列系统发育分析，采用邻接法。通过1000次重复的靴带分析评估构建的系统发育树的统计可靠性。

为了过量表达酯酶蛋白，将携带pET-28a(+)-酯酶的重组*E. coli* BL21 (DE3)细胞在含有1 L LB培养基和50 μg/mL卡那霉素的5 L baffled烧瓶中培养，摇速为150 rpm，温度为30°C，持续18小时。为了最大化可溶性蛋白的产量，系统优化了诱导条件，包括IPTG的最终浓度（0.1–1 mM）、诱导后温度（18–30°C）和培养时间（4–18小时）。发现1 mM IPTG在30°C下培养18小时的条件能提供最高的可溶性酯酶活性。因此，在所有后续实验中，通过在OD600约为0.6时加入1 mM IPTG进行过表达诱导，并在这些最佳条件下继续培养。培养结束后，通过离心（10,000 × g）收集酯酶表达细胞，用于后续实验。细胞用1%（w/v）SDS溶液洗涤两次，重新悬浮于磷酸盐缓冲盐水（PBS），并通过超声波处理破碎。通过离心（10,000 × g）收集裂解物。使用Ni-NTA Fast Start Kit（QIAGEN，Valencia，CA，United States）按照制造商说明从裂解物中纯化重组蛋白。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE；Mini-PROTEAN系统，Bio-Rad，Hercules，CA，United States）分析纯化酯酶的相对分子质量。电泳结束后，通过Coomassie Brilliant Blue R 250染色凝胶，可视化蛋白质。根据Vandooren等人（2013年）的方法进行zymography分析，略有修改。对于zymograms，含有纯化重组酯酶的凝胶被用50 mM Tris–HCl缓冲液（pH 8.0）洗涤15分钟，然后放置在含有1%（v/v）acryl PU-Siegel作为底物的基质凝胶上。zymogram在28°C下过夜培养，并在第二天进行分析。

通过重组酯酶对PAU的降解能力进行了定量分析。使用纯化的重组酯酶，按照Kim等人（2022a，2022b）的方法，基于从IBT73和IBT82菌株中分离出的纯化重组酯酶进行分析。准备了100 g/L的acryl PU-Siegel悬浮液（10 mM磷酸盐，137 mM NaCl，2.7 mM KCl，pH 7.4）作为储备溶液，使用1%（v/v）的工作悬浮液进行该实验。通过将acryl PU-Siegel悬浮液与蒸馏水稀释，构建标准曲线以将吸光度转化为百分比清除。在实验中，将50 U的纯化重组酯酶加入5 mL的acryl PU-Siegel悬浮液中，并在30°C下培养48小时，每隔12小时测量600 nm的光密度（OD600）。观察到吸光度随时间显著下降，表明悬浮液的清除程度增加。

通过傅里叶变换红外（FTIR）光谱分析，确定了acryl PU-Siegel在降解后的聚合物键形成变化。在48小时培养后，将生物降解实验中的上清液转移至Eppendorf管，并使用冷冻干燥机（Alpha 1–4 LD plus，Martin Christ，Osterode，Germany）进行冷冻干燥。记录了这些冷冻干燥样品的光谱，包括未处理样品作为阴性对照，分辨率为4 cm?1，波数范围为500至4000 cm?1，室温下进行。所有实验均在相同条件下进行三次重复。

通过气相色谱-质谱（GC–MS）分析了由IBT73和IBT82纯化重组酯酶降解acryl PU-Siegel产生的代谢中间产物。将生物降解实验中的上清液转移至Eppendorf管，并通过0.45 μm孔径的滤膜（Millipore，Burlington，MA，USA）过滤。为后续GC–MS分析准备样品，使用二氯甲烷提取滤液。提取后的二氯甲烷样品在25°C下真空干燥。最后，将干燥样品溶解在100 μL己烷中，进行GC–MS分析。GC/MS系统（ISQ LT，Thermo Scientific，USA）配备了自动液态采样器和三向Silflow模块，以同时检测火焰离子化检测器和MS。GC分离使用VF-5MS毛细管柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm），氦气作为载气，流速恒定为1.0 mL/min。样品（1 μL）以无分流模式注入。温度程序如下：60°C（3分钟保持），以10°C/min的速率升至280°C，并保持10分钟。质谱检测采用电子轰击（EI）。使用四极单MS和光电倍增管检测器收集谱图，进行全扫描（m/z 35–550）和SIM模式。代谢物鉴定基于与国家技术标准局库的光谱匹配，匹配因子阈值>80%视为正确认定。

通过单因素方差分析（ANOVA）使用SPSS软件（版本24，SPSS，Inc.，Chicago，IL，USA）进行统计分析。通过Scheffé方法比较均值，并将P值<0.05视为统计显著。

在结果和讨论部分，我们发现了菌株IBT73和IBT82作为PAU降解细菌的潜力。在含有1%（v/v）acryl PU-Siegel的1/5强度R2A琼脂上，菌株能够产生透明的清除区，表明其具有PAU降解能力。菌株IBT73和IBT82被评估其对PAU组分的胞外酶活性。琼脂板实验确认了这两种菌株能够产生胞外蛋白酶（通过透明清除区的形成）和酯酶（通过钙复合物的形成）。相比之下，尿酶实验仅显示IBT73具有活性。这些结果表明，菌株IBT73和IBT82通过分泌胞外酶具备降解PAU的潜力。两个菌株IBT73和IBT82被选为PAU降解的有前景候选，并被储存以进行进一步的生物降解研究。根据部分16S rRNA区域，菌株IBT73与*Serratia marcescens* ATCC13880（JMPQ01000005）具有99.45%的16S rRNA核苷酸序列相似性。菌株IBT82与*Pseudomonas yamanorum* 8H1（EU557337）具有99.64%的16S rRNA核苷酸序列相似性。两种分离株*Serratia* sp. IBT73和*Pseudomonas* sp. IBT82的16S rRNA基因序列已存入GenBank数据库，编号分别为PX393517和PX393518。

PU主要由多元醇和异氰酸酯组成，通过氨基甲酸酯（尿烷）键（-NHCOO-）连接。这种结构特征使得PU固有地对生物降解具有抵抗力；然而，某些微生物和酶可以特异性地靶向这些键。多种细菌和真菌利用其酶系统降解各种聚合物，使其可被吸收和代谢。酯酶、蛋白酶、脂肪酶和尿酶主要参与PU中酯和尿烷功能基团的水解和分解。此外，这些酶之间可能的协同作用和共代谢相互作用也可能有助于提高不同PU组分的总体生物降解效率。如图1所示，酯酶可以水解酯键，蛋白酶可以切断肽键，尿酶可以分解尿素键，这些酶的协同作用可能共同促进PU的降解。基于这些发现，我们进一步分析了PAU降解产物，使用GC–MS确定了可能的代谢中间产物，以确认由FTIR分析建议的降解途径。

然而，当前研究的一个限制是，由于缺乏全基因组序列，无法全面识别负责PU降解的酶系。虽然表征的酯酶在观察到的降解中起着重要作用，但可能整体降解效率源于多种未表征的水解酶的协同作用。因此，为了进一步发展这些发现，对这两种菌株进行全基因组测序是必要的。这将使我们能够进行全面的生物信息学分析，以识别所有可能的降解酶，并提供更全面的了解PU生物降解的生化途径。

在PAU降解中间代谢物的鉴定中，我们使用GC–MS分析了由IBT73和IBT82纯化重组酯酶降解acryl PU-Siegel产生的代谢中间产物。经过3天的培养，我们鉴定了3-羟基丙酸，这是丙烯酸的衍生物。此外，还检测到了乙二醇和1,2-丙二醇，这些来自聚醇结构中酯键的分解。同时，还观察到了苯乙烯和甲基水杨酸，它们来自各种苯环，以及小分子量的有机酸，如甲酸。基于这些发现，我们推断了acryl PU-Siegel的降解途径。这些产物表明微生物能够将PAU衍生的化合物整合到三羧酸循环（TCA循环）及相关代谢途径中。3-羟基丙酸通过甲基丙二酰辅酶A途径转化为琥珀酰辅酶A，进入TCA循环。乙二醇和1,2-丙二醇通过氧化转化为甘醇酸和乳酸，这些代谢物通过甘油酸或丙酮酸代谢进入TCA循环。苯乙烯和甲基水杨酸代表PAU的芳香结构，转化为苯乙酸和儿茶酚，这些代谢物进一步通过β-酮戊二酸途径转化为TCA中间产物，如乙酰辅酶A和琥珀酰辅酶A。甲酸和CO2代表最终氧化产物，表明PAU衍生化合物的完全矿化。这些结果表明，微生物能够将不同的PAU降解产物整合到中心碳代谢中，支持能量生成和生物量形成。然而，虽然观察到的代谢中间产物提供了关于PAU降解的见解，但确切的代谢途径仍不明确，需要进一步的生化和遗传验证。此外，我们的代谢物分析是定性的，提供了降解产物的比较概况。未来的研究应使用内部标准进行绝对定量，以确定这些中间产物的确切浓度，并更好地理解这些代谢途径中的动力学通量。

从生态和应用的角度来看，昆虫表现出对各种环境因素的显著适应性，这些适应性与它们肠道微生物的动态特征和功能密切相关。昆虫相关微生物能够产生多种生物活性分子和有效的消化酶，具有广泛的生物技术工业应用潜力。此外，昆虫相关肠道微生物已被广泛研究其生物修复能力，利用污染物、毒素等作为营养来源。近年来，昆虫及其肠道微生物因其在解决环境问题方面的潜力而受到越来越多的关注，尤其是在塑料生物降解领域。到目前为止，已经报道了多种来自昆虫肠道的细菌菌株能够降解合成塑料，包括从* Tenebrio molitor*中分离的* Exiguobacterium* sp. YT2和从* Tribolium castaneum*中分离的* Acinetobacter* sp.。同样，从* Plodia interpunctella*中分离的* Bacillus* sp. YP1和* Enterobacter asburiae* YT1已被证实能够降解PE。此外，从* T. molitor*中分离的* Acinetobacter* sp. NyZ450和* Bacillus* sp. NyZ451也表现出对PE的降解能力。另外，从* Spodoptera frugiperda*幼虫肠道中分离的* Klebsiella* sp. EMBL-1已被报道能够分解聚氯乙烯并将其作为唯一的碳源。尽管已经鉴定了一些昆虫肠道来源的PU降解微生物和其相关的酶，如从* Tenebrio molitor* L中分离的* Mixta tenebrionis* BIT-26和从* Galleria mellonella*中分离的* Staphylococcus warneri* UFV_01.21，但对这些细菌的多样性及其用于PU降解的精确酶促途径的全面理解仍是一个正在进行的研究重点。据我们所知，这是第一项报告表明红脉蜻蜓来源的微生物在PAU降解方面表现出显著活性，并强调其从昆虫肠道中分离出的外源酯酶的作用。然而，当前研究的一个关键限制是，我们的发现基于单个样本的分析。这种案例研究方法在初步深度分析中是宝贵的，但它无法考虑物种内的潜在个体差异。因此，尽管我们的结果提供了概念验证，但为了确认这些发现并确立其普遍性，未来需要使用更大的样本量和多个生物重复进行研究。

鉴于PU在工业上的广泛应用及其各种配方，包括基于PS、PE和聚丙烯酸酯的结构，其降解需要一种能够处理不同化学成分的灵活微生物系统。这些菌株能够降解多种PU类型，表明它们在工业和环境应用中的广泛潜力。进一步调整生长条件、酶表达或微生物群落可能提高降解效率。对于未来应用，需要评估这些菌株在生物反应器系统中的可扩展性和其在PU表面的生物膜形成能力。这些菌株的潜在成功得益于相关物种已知的耐受性。例如，*Serratia marcescens*已被证实能够耐受重金属并在压力下增强生物膜形成。类似地，假单胞菌属表现出对工业胁迫因子如有毒溶剂的耐受性，其生物膜能够在pH和盐度波动中保持韧性，同时定植于聚氨酯表面。这种相关属的已知耐受性，结合我们在实验中观察到的生物膜形成，为研究这些菌株在实际生物降解场景中的应用提供了强有力的依据。

综上所述，本研究展示了从红脉蜻蜓肠道中分离的*Serratia* sp. IBT73和*Pseudomonas* sp. IBT82能够生物降解多种PU材料。这两种菌株均表现出胞外酶活性，并能够产生水解PAU的酯酶。转录组分析显示，IBT73通过增强小分子代谢途径来适应降解条件，而IBT82则强调应激耐受机制。FTIR和GC–MS分析确认了尿烷、酯和芳香键的裂解以及中间产物的产生，这些中间产物整合到中心代谢途径中。尽管观察到的降解率相对温和，进一步的优化仍需提高效率，但这些菌株在降解结构不同的PU类型方面表现出的多功能性凸显了它们在针对PU废弃物回收和环境修复的生物技术策略中的强大潜力。