通过Diosmin-Ezetimibe介导的MDM2抑制作用在骨肉瘤细胞中实现非基因毒性的p53重新激活

《In Silico Research in Biomedicine》：Non-genotoxic p53 Reactivation via Diosmin-Ezetimibe-Mediated MDM2 Inhibition in Osteosarcoma Cells

本研究通过细胞实验和分子模拟，探讨了Diosmin（DIO）与Ezetimibe（EZE）联合对骨肉瘤SJSA-1细胞的作用机制。结果显示，两者协同显著抑制MDM2表达（qPCR和Western blot证实），稳定p53蛋白（非基因组毒性途径），诱导凋亡（Annexin V/PI分析显示凋亡率提升），其IC50为7.0 μM，接近多柔比星毒性但坏死较少。分子动力学模拟表明DIO和EZE与MDM2结合口袋稳定，DIO-EZE组合通过竞争性抑制MDM2-p53相互作用，实现更安全有效的p53激活。

　　这项研究聚焦于一种新的治疗策略，即通过结合两种不同类型的化合物——橙皮苷（Diosmin, DIO）和依折麦布（Ezetimibe, EZE）来对抗骨肉瘤细胞。研究对象是SJSA-1细胞系，这是一种来源于一名19岁黑人男性骨肉瘤患者的细胞，具有较高的MDM2扩增和野生型TP53表达的特征。MDM2作为p53的负调控因子，其过度表达会促进p53的泛素化和蛋白酶体降解，从而抑制p53的肿瘤抑制功能。因此，破坏MDM2与p53之间的相互作用被认为是一种恢复p53功能并诱导肿瘤细胞死亡的有前景的策略。

研究结果显示，DIO与EZE的组合在SJSA-1细胞中表现出显著的剂量依赖性细胞毒性作用。在较低浓度下，如DIO 0.5 μM与EZE 0.5 μM的组合，细胞存活率的下降并不显著；而当浓度提升至5 μM和10 μM时，细胞存活率明显下降，其中最高剂量（20 μM）的细胞毒性接近标准化疗药物多柔比星（DOX）在高剂量下的效果。细胞形态学分析和Annexin V/PI染色实验进一步表明，DIO-EZE组合主要诱导细胞凋亡，而几乎不引起细胞坏死，这提示其具有更安全的细胞毒性特征，相较于DOX可能减少对正常细胞的损害。

与DOX不同，DIO-EZE组合并未显著增加p53的表达水平，但显著降低了MDM2的表达。这表明该组合通过非基因毒性途径稳定了p53蛋白，而非通过DNA损伤触发的p53激活。此外，分子对接和100 ns分子动力学模拟分析显示，DIO和EZE均与MDM2结合口袋中的关键残基（如HIS96、VAL93、TYR100、ILE61和MET62）发生显著的疏水相互作用，并且在动态条件下保持稳定的构象。EZE表现出最小的构象变化，这可能意味着其在MDM2结合口袋中的结合更为稳定。根均方偏差（RMSD）、主成分分析（PCA）、自由能景观（FEL）和每残基能量分解分析进一步支持了这两种化合物在结构稳定性和结合能方面的良好表现。

在实验结果方面，DIO和EZE的联合治疗不仅在细胞活力方面表现出显著的抑制作用，还在凋亡相关蛋白的表达和细胞死亡途径中展现出不同的调节模式。例如，通过流式细胞术检测，DIO-EZE组合显著增加了早期和晚期凋亡细胞的比例，同时维持了较低的坏死率。相比之下，DOX虽然能有效诱导凋亡，但其引发的坏死率较高，这可能与其诱导DNA损伤和自由基生成的机制有关。这种凋亡导向的细胞死亡方式被认为在抗肿瘤治疗中更具优势，因为它可能减少与坏死相关的炎症反应和组织损伤。

从分子机制来看，DIO和EZE可能通过不同的途径影响MDM2-p53轴。DIO可能通过抑制MDM2的表达来稳定p53，而EZE可能通过直接干扰MDM2与p53的结合，从而促进p53的功能恢复。这些作用的结合可能形成一种协同效应，提高抗肿瘤效果。同时，DIO的天然来源（柑橘类水果）和EZE的已知临床应用（降低血脂）使得它们的联合使用在安全性方面具有潜力，尤其在长期治疗过程中，可能减少传统化疗药物带来的毒副作用。

分子动力学模拟进一步揭示了DIO和EZE在MDM2结合口袋中的结合特性。模拟结果显示，DIO和EZE均能稳定地结合在MDM2的活性位点，并且在200 ns的模拟过程中，其构象保持相对稳定。而DOX虽然在分子对接中表现出较高的结合能，但其在模拟过程中表现出较大的位移和波动，这可能与其主要依赖疏水相互作用的结合模式有关。这种不稳定的结合特性可能导致DOX在体内更容易发生脱靶效应，从而引发不必要的副作用。

此外，研究还对每残基结合能进行了分解分析，结果显示DIO的结合能显著高于EZE和DOX，这表明其对MDM2的结合更为有利。然而，EZE的结合能也显示出较高的稳定性，这可能与其在结合口袋中形成的多重疏水相互作用有关。这种能量稳定性的差异可能与两种化合物在体内维持其抗肿瘤活性的时间和强度有关，进而影响其临床应用的潜力。

在总结方面，DIO和EZE的联合治疗在SJSA-1细胞中展现出良好的抗肿瘤效果，且其作用机制可能涉及非基因毒性途径的p53激活。这一发现为骨肉瘤的治疗提供了一种新的思路，尤其是在面对传统化疗药物的耐药性和副作用问题时。未来的研究需要进一步验证这一机制的可行性，并在动物模型中进行体内实验，以评估其在实际治疗中的效果和安全性。此外，还需要对p53的激活是否依赖于DNA损伤进行深入研究，以确保其在不同病理条件下均能发挥预期的治疗作用。