WDFY2通过促进MRN复合物形成调控同源重组修复的新机制及其在癌症治疗中的潜在价值

《Cell Reports》：WDFY2 promotes MRN complex formation required for homologous recombination-mediated DNA repair

本研究针对DNA双链断裂(DSB)修复中MRN复合物招募机制不清的问题，揭示了WDFY2作为ATM-CHK2信号轴下游关键效应分子，通过Ser84磷酸化介导MRE11与NBS1的结合，促进MRN复合物在DSB位点的组装和DNA末端切除，从而增强同源重组(HR)修复效率。该发现为肿瘤放射/化学治疗耐药性提供了新的靶向策略。

　　

当我们身体的细胞每天遭受数以万计的DNA损伤时，一套精密的修复机制便悄然启动，守护着基因组的完整性。其中，DNA双链断裂(DSB)是最为严重的损伤类型，若修复不当，极易导致细胞癌变或死亡。细胞主要通过两种途径修复DSB：容易出错的非同源末端连接(NHEJ)和以姐妹染色单体为模板的高保真同源重组(HR)。在HR修复的起始阶段，MRE11-RAD50-NBS1(MRN)复合物如同"分子哨兵"迅速定位到断裂处，启动DNA末端切除并招募下游修复蛋白。然而，这个关键复合物是如何在损伤位点精准组装的？其中是否存在尚未发现的"组织者"？这些问题一直是DNA损伤应答(DDR)领域的未解之谜。

深圳大学朱卫国教授团队在《Cell Reports》发表的研究论文，首次发现含有WD40和FYVE结构域的蛋白WDFY2在HR修复中扮演着重要角色。以往认为WDFY2主要参与细胞内吞等胞质过程，但这项研究揭示其核内群体具有全新的DNA修复功能。通过构建Wdfy2基因敲除小鼠模型，研究人员观察到缺失该基因的小鼠在X射线照射后生存率显著降低，肠道组织出现严重DNA损伤和细胞凋亡，提示WDFY2在体内对辐射防护具有关键作用。

为深入探索机制，研究团队运用了多种关键技术：通过CRISPR-Cas9构建基因敲除细胞系；采用免疫共沉淀(Co-IP)和GST pull-down分析蛋白质相互作用；利用激光微辐照技术实时观察蛋白招募动力学；通过染色质免疫沉淀(ChIP)验证特定DSB位点的蛋白富集；使用DR-GFP/EJ5-GFP报告系统量化HR/NHEJ效率；借助彗星实验和染色体铺展分析评估DNA损伤与修复；此外还建立了肿瘤异种移植模型进行临床前验证。

WDFY2是促进DSB修复的关键因子

研究人员发现WDFY2缺失细胞在电离辐射(IR)和依托泊苷处理后，γH2AX焦点持续存在，中性彗星实验显示DNA损伤修复延迟，染色体畸变增加，表明WDFY2对维持基因组稳定性至关重要。

WDFY2被招募至DNA损伤位点促进HR修复

生化分级实验显示WDFY2与染色质结合且在DNA损伤后显著增强。通过AsiSI-ER系统和mCherry-FokI报告系统，证实WDFY2特异性地富集于DSB位点。功能实验表明WDFY2敲低显著损害HR效率，但不影响NHEJ，且导致BRCA1焦点形成缺陷。

ATM-CHK2轴介导的WDFY2 Ser84磷酸化是其向损伤染色质招募的必要条件

研究发现DNA损伤诱导WDFY2丝氨酸磷酸化增强，而ATM和CHK2抑制剂可阻断此过程。质谱分析鉴定出Ser84为CHK2直接磷酸化位点，磷酸化缺陷突变体(S84A)损伤位点招募能力显著受损。

WDFY2通过与MRE11和NBS1相互作用促进MRN复合物向损伤染色质招募

质谱分析发现WDFY2与MRN复合物相互作用。Co-IP和PLA实验证实WDFY2与MRE11、NBS1直接结合，且相互作用在DNA损伤后增强。结构域映射显示WDFY2的N端与MRE11(1-247 aa)和NBS1(219-327 aa)片段相互作用。WDFY2缺失显著损害MRN组分向损伤染色质的招募。

WDFY2是DSB处MRN复合物形成所必需的

WDFY2缺失不影响MRE11-RAD50亚复合物稳定性，但显著减弱DNA损伤诱导的MRE11-NBS1相互作用。体外实验显示WDFY2可促进MRE11与NBS1结合。重要的是，S84A突变体无法恢复MRN复合物形成，而S84D磷酸模拟突变体具有与野生型相似的功能。

WDFY2促进DNA末端切除

在AsiSI诱导的DSB位点，WDFY2敲低导致单链DNA(ssDNA)生成减少。同时，RPA和RAD51向染色质的招募以及焦点形成在WDFY2缺失细胞中受损，表明其在DNA末端切除中发挥关键作用。

WDFY2是癌症治疗中一个有前景的靶点

功能回复实验显示，WDFY2(WT)和(S84D)能恢复HR修复效率并减轻IR诱导的染色体畸变，而(S84A)和(MRE11结合缺陷突变体Q134A)无此功能。动物实验表明，WDFY2缺失或S84A突变肿瘤对放疗更敏感。临床数据分析显示WDFY2高表达与结肠癌患者治疗抵抗和不良预后相关。

这项研究系统阐明了WDFY2在DNA损伤修复中的新功能，提出了"ATM-CHK2-WDFY2-MRN"正反馈调控模型：DNA损伤激活ATM，活化的ATM磷酸化CHK2，后者进而磷酸化WDFY2 Ser84位点，促使WDFY2招募至DSB区域，作为分子支架促进MRE11与NBS1的结合，从而完成MRN复合物的组装，增强DNA末端切除和HR修复效率。该发现不仅深化了对DDR机制的理解，更重要的是为肿瘤治疗提供了新策略——针对WDFY2的干预可能增强传统化疗和放疗的疗效，特别是在WDFY2高表达的恶性肿瘤中。研究局限性在于尚未解析WDFY2-MRN复合物的精细结构，且WDFY2缺陷表型较MRN组分缺陷温和，提示可能存在补偿机制，这为后续研究指明了方向。