基质胶（Matrigel）的独特作用使得在三维悬浮培养条件下，人类胚胎干细胞能够分化出可扩增的肝母细胞（hepatoblasts）和极化的肝细胞类器官（polarized hepatocyte organoids）

《BIOMATERIALS RESEARCH》：Distinct Roles of Matrigel Enabled the Production of Expandable Hepatoblast and Polarized Hepatocyte Organoids from Human Embryonic Stem Cells under 3-Dimensional Suspension Conditions

肝类器官三维悬浮培养中Matrigel通过调控ROS-自噬平衡和FAK-ERK-AMPK通路促进肝前体细胞扩展及肝细胞极化成熟，并验证其作为人工生物活性水凝胶的潜力。

　　肝是人体中至关重要的器官，参与多种代谢功能，包括解毒、代谢和蛋白质合成，对维持机体稳态和整体健康起着关键作用。随着器官类器官技术的发展，从原始人肝细胞（PHH）和人类多能干细胞中已经成功构建了多种肝类器官，如肝细胞类器官、胆管上皮类器官、肝胆类器官以及多谱系肝类器官。这些类器官的建立为研究肝脏发育、疾病模型构建、药物筛选以及再生医学提供了新的机会。然而，目前肝类器官的培养仍然面临诸多挑战，尤其是在模拟体内微环境方面，尤其是细胞外基质（ECM）的复制。

在本研究中，我们探讨了Matrigel（MG）在三维悬浮条件下，对从人胚胎干细胞（hESCs）衍生的肝前体细胞类器官（HB-orgs）的增殖、极化和功能成熟的作用。通过多种实验方法，我们发现低浓度的Matrigel能够通过抑制ROS-AMPK-mTOR介导的过度自噬，调节ROS-自噬平衡，从而支持HB-orgs的高效增殖。此外，Matrigel还能够通过激活FAK-ERK-AMPK通路，促进由HB-orgs分化而来的成熟肝细胞类器官（P-hep-orgs）的极化和功能成熟。这些发现强调了整合素信号在肝细胞类器官培养中的重要性，并为开发用于临床应用的合成、生物活性水凝胶提供了理论依据。

在实验方法方面，我们采用了多种技术手段来评估细胞的活力、毒性、极化和功能。例如，通过RNA测序分析不同条件下的基因表达差异，利用流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况，通过免疫荧光染色观察细胞极化标志物的分布，以及通过透射电镜检查细胞结构。这些方法帮助我们更全面地理解Matrigel在肝细胞类器官培养中的作用机制。同时，我们还进行了药物毒性评估，通过将P-hep-orgs暴露于多种已知的肝毒性化合物，观察其对细胞活力的影响，并利用CDFDA染色检测胆汁合成障碍（cholestasis）的发生情况。结果显示，P-hep-orgs在预测药物毒性方面表现出更高的敏感性，相较于传统的人肝细胞系如HepG2细胞，其毒性响应更接近临床实际。

在研究结果中，我们发现Matrigel对于HB-orgs的增殖至关重要。在没有Matrigel的情况下，HB-orgs的增殖率显著下降，同时表现出较高的细胞凋亡率和较低的细胞活力。相反，添加5%的Matrigel后，HB-orgs不仅能够形成结构完整的类器官，还能够维持较高的细胞活力和正常的增殖能力。这表明，Matrigel在促进HB-orgs增殖和维持其未分化状态方面具有重要作用。此外，Matrigel还能够诱导P-hep-orgs的极化和功能成熟，这通过检测极化标志物（如ZO1、MDR1和NTCP）的表达情况以及细胞功能（如白蛋白分泌、胆汁酸生成和CYP酶活性）得到了验证。

进一步的基因表达分析表明，与未极化的肝细胞球体（NP-hep-spheres）相比，P-hep-orgs中与成熟肝细胞功能相关的基因表达水平显著提高，包括与胆汁酸代谢、氮代谢、药物代谢和葡萄糖代谢相关的基因。这些结果不仅验证了P-hep-orgs的成熟状态，还表明其在药物代谢和毒性评估中的潜力。通过比较不同细胞类型对药物的响应，我们发现P-hep-orgs的毒性曲线更接近临床观察，从而强调了其在药物安全性评估中的重要性。

此外，我们还探讨了Matrigel诱导肝细胞类器官极化的分子机制。通过使用整合素结合抑制剂GRGDSP，我们发现整合素信号的阻断会显著影响P-hep-orgs的极化过程，导致其结构变得不规则，并降低极化相关蛋白（如BSEP、STX3和RAB8）的表达。同时，Western blot分析显示，pFAK、pERK和pAMPK的表达水平在整合素信号被阻断的情况下显著下降，表明整合素-FAK-ERK-AMPK通路在P-hep-orgs的极化过程中起着关键作用。这一发现为未来设计更有效的合成水凝胶提供了重要的线索。

研究结果还表明，Matrigel不仅在维持肝细胞类器官的增殖和功能方面至关重要，还在促进其极化过程中发挥着不可或缺的作用。通过比较不同培养条件下类器官的基因表达和功能表现，我们发现Matrigel能够通过调控整合素信号，激活FAK和ERK，从而促进AMPK的激活，最终实现肝细胞的极化。这一机制为未来开发能够模拟体内微环境的合成水凝胶提供了理论基础。

此外，研究还指出，虽然目前已经开发出多种基于天然细胞外基质的水凝胶用于支持肝细胞类器官的培养，但其分子机制仍不完全清楚。通过RNA测序和功能分析，我们发现Matrigel的加入显著改变了类器官的基因表达谱，尤其是在与自噬和ROS调控相关的通路中。这些发现不仅有助于理解细胞外基质在类器官发育中的作用，也为未来开发更精准的合成水凝胶提供了方向。

综上所述，本研究揭示了Matrigel在促进肝细胞类器官增殖和极化中的关键作用，并强调了整合素信号在这一过程中的重要性。通过这些发现，我们为未来构建更符合体内环境的肝类器官培养体系提供了理论支持和实验依据。此外，这些结果也对肝疾病模型构建、药物筛选和再生医学的应用具有重要意义。未来的研究可以进一步探索特定整合素亚基在这一过程中的作用，并通过系统比较天然与合成基质，优化人工水凝胶的设计，以更好地支持肝细胞类器官的长期培养和功能维持。