GH25溶菌酶在植物叶面上介导了不同生物界之间的相互作用以及微生物间的竞争

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：GH25 lysozyme mediates tripartite interkingdom interactions and microbial competition on the plant leaf surface

研究揭示白锈病原菌Albugo laibachii通过其共生的Curtobacterium sp.与酵母Moesziomyces bullatus形成三方拮抗网络，MbhA分泌的GH25酶特异性抑制Curtobacterium sp.间接控制病原菌，且病原菌与Curtobacterium sp.存在互利共生关系。

　　植物相关的微生物群落对于植物健康和抗病能力具有重要作用。这项研究揭示了一种三元跨界的微生物相互作用，涉及一种担子菌酵母、一种卵菌病原体以及一种共生细菌。观察到的对抗作用是通过酵母分泌的一种甘露糖苷酶25（GH25）蛋白实现的，这种蛋白能够选择性地抑制病原体的关键微生物共生者。我们的研究结果为理解叶面微生物群落的动态提供了细致的机制性见解，并提出了通过调控微生物组来控制疾病的新策略。

植物病原体，如细菌、真菌、卵菌和病毒，会引发多种植物疾病。特别是卵菌和真菌病原体对许多重要的农业作物构成威胁，这可能影响全球粮食安全。例如，卵菌*Phytophthora infestans*曾在1845年导致爱尔兰大饥荒，通过引起马铃薯晚疫病。其他*Phytophthora*种类，如*Phytophthora ramorum*、*Phytophthora capsici*和*Phytophthora sojae*，分别感染橡树、茄科作物和大豆。*Botrytis cinerea*是一种宿主范围广泛的真菌病原体，能够对作物造成严重经济损失，其控制主要依赖于杀菌剂的应用。此外，气候变化预计会通过病原体菌株的出现和演化加剧植物病害爆发，这可能影响自然生物多样性和农业生态系统。

微生物对抗或生物控制病原体已成为一种有效的植物保护方法。例如，通过抑制活动的土豆相关细菌可以控制*Phytophthora*病害，或者通过细菌和真菌分泌的挥发性物质实现生物控制。因此，深入了解微生物对抗的机制对于成功实现作物保护至关重要。虽然已经描述了多种微生物拮抗剂的作用机制，如触发植物免疫反应、寄生在病原体上或分泌次级代谢产物，但与相关微生物的竞争可能是有效控制病原体和恢复植物健康的重要因素。在这些相互作用中，*Albugo laibachii*作为一种导致白锈病的微生物枢纽，已被发现会促进*Arabidopsis*叶面的微生物失衡。

植物微生物群落会分泌多种甘露糖苷酶（GH），这些酶有助于营养获取、与其他微生物竞争，或者作为侵染宿主的毒力因子。例如，拮抗真菌如*Trichoderma*被报道会产生多种水解酶以对抗作物中的真菌病原体。例如，*Trichoderma asperellum* PQ34分泌的几丁质酶可以抑制*Fusarium*和*Colletotrichum*的生长。此外，*Trichoderma harzianum*中编码纤维素的基因被发现能够通过上调玉米根部的DIMBOA和其他防御相关基因的表达，从而引发植物免疫反应。

甘露糖苷酶是水解酶中最大的一类，包含172个家族和18个不同的GH族。在植物病原真菌中，GH家族主要被研究其在触发植物免疫和病原体毒力中的作用。例如，卵菌*P. sojae*和真菌*Verticillium dahliae*、*Magnaporthe oryzae*和*Fusarium oxysporum*分泌的GH能够作为微生物相关分子模式（MAMPs）或释放损伤相关分子模式（DAMPs），从而激活植物防御反应的第一层——模式触发免疫（PTI）。然而，对于GH25在真菌中的生物功能仍知之甚少。

在之前的研究中，我们描述了担子菌酵母*Moesziomyces bullatus* ex. *Albugo*（简称MbA）如何通过分泌GH25蛋白调控*Arabidopsis thaliana*的叶面微生物群落，从而抑制白锈病病原体*Albugo laibachii*。GH25家族的水解酶具有一个DXE活性位点，能够水解细菌肽聚糖中N-乙酰胞壁酸（NAM）和N-乙酰葡萄糖胺（NAG）之间的β-1,4-糖苷键。然而，GH25在真菌中的生物功能仍不明确。

为了进一步探讨GH25如何对抗*Albugo laibachii*，我们分析了GH25在真菌界的进化保守性。先前的研究表明，不同真菌群体，如担子菌、子囊菌和接合菌，其GH25氨基酸序列中的DXE活性位点高度保守。我们构建的系统发育树显示，Ustilaginales中的GH25，包括MbA和*Ustilago maydis*，在序列相似性方面高度聚类。然而，进化上更为多样的子囊菌，包括一些植物病原体，其GH25同源物也显著保守。同源物在序列相似性和结构保守性方面表现出高度一致性（MbA与*U. maydis*的百分比同源性为77.87%，均方根偏差为0.243；MbA与*R. solani*的百分比同源性为51.25%，均方根偏差为0.481）。我们通过重组表达技术在*U. maydis*野生型菌株FB1中表达了来自MbA、*U. maydis*和*R. solani*的三个同源物。重组菌株的表达水平通过qPCR进行了验证。随后，这些重组菌株被接种到*Arabidopsis*幼苗上，并在接种*Albugo laibachii*后评估感染症状。结果显示，表达来自MbA和*U. maydis*的活性GH25显著抑制了*Albugo laibachii*的感染，而来自*R. solani*的GH25则没有此效果。因此，MbA和*U. maydis*的GH25在抑制*Albugo laibachii*方面的功能是保守的，而*R. solani*的GH25则没有类似作用。

为了进一步明确GH25是否通过激活植物免疫反应或直接抑制病原体来发挥对抗作用，我们测试了MbA GH25对植物免疫的影响。我们将*Arabidopsis*幼苗用纯化的重组MbA GH25蛋白、突变的GH25蛋白（D124A）或热失活的GH25蛋白进行处理，并在处理后30分钟和6小时收集幼苗以检测防御标记基因的表达情况。我们发现，GH25处理仅略微上调了植物防御基因的表达，且在活性和非活性版本之间没有显著差异。因此，我们得出结论，MbA GH25的酶活性很可能不会激活植物的防御机制。

同时，我们测试了MbA GH25是否能直接抑制卵菌。卵菌的细胞壁主要由β-1,3和β-1,6葡聚糖组成，而NAG是细菌肽聚糖的构建单元。为了确定GH25是否直接作用于卵菌细胞壁，我们使用商用的海藻多糖Laminarin作为底物，通过薄层色谱法监测GH25处理后是否释放寡糖。结果显示，GH25对Laminarin没有活性。此外，我们从收获的卵菌游动孢子中分离细胞壁，并检测了MbA gh25基因的表达情况。然而，在生长的MbA培养物中没有检测到gh25表达的显著上调。因此，我们无法获得直接抑制卵菌的实验证据。

为了确定MbA/ GH25的对抗活动是否特异性针对*Albugo laibachii*，我们测试了其与卵菌病原体*Hyaloperonospora arabidopsidis*（Hpa）和*Phytophthora infestans*（P. infestans）以及真菌病原体*Botrytis cinerea*（B. cinerea）的相互作用。在*Arabidopsis*幼苗上，MbA和GH25对Hpa的感染没有显著影响，无论是否使用活性或非活性版本。此外，*Albugo laibachii*的感染对*eds1-12*突变体的感染率显著高于野生型Col-0，这表明Hpa在*Arabidopsis*上的感染条件是合适的。然而，*P. infestans*的感染情况并未受到MbA或GH25的明显影响。在分离的细菌群落中，我们发现*Albugo laibachii*与细菌共存，并且这些细菌在植物感染过程中被招募以限制疾病进展。因此，我们假设GH25通过抑制*Albugo laibachii*的细菌共生者来发挥其对抗作用。

我们进一步测试了这些细菌与GH25之间的相互作用。在无菌条件下，我们发现MbA对两种*Pseudomonas*菌株具有抑制作用，而重组表达的GH25蛋白对两种*Curtobacterium*菌株表现出显著的抑制效果。我们还进行了细胞存活率检测，发现活性GH25显著降低了*Curtobacterium* sp. #2和#1的存活细胞数，而对*Staphylococcus* sp.的存活率没有影响。因此，GH25对*Curtobacterium* sp.表现出杀菌活性。此外，我们发现*Curtobacterium* sp. #2的存活率比#1显著降低，表明GH25对#2的抑制更为有效。这些结果表明，GH25主要针对*Curtobacterium* sp.进行作用。

在进一步的研究中，我们探讨了*Curtobacterium* sp. #2如何影响*Albugo laibachii*的感染。我们发现，在*Albugo laibachii*感染过程中，*Curtobacterium* sp. #2能够显著恢复其感染能力，即使在存在MbA的情况下。这表明*Curtobacterium* sp. #2与*Albugo laibachii*之间存在一种保护性相互作用。此外，我们还测试了GH25在不同细菌群落中的作用。在无菌条件下，我们发现*Curtobacterium* sp. #1和#2以及*Pseudomonas* sp. #1和#2能够显著抑制未被GH25影响的其他细菌，表明这些细菌在微生物群落中具有较强的抑制能力。基于这些发现，我们假设*Curtobacterium* sp.和*Pseudomonas* sp.可能通过抑制其他微生物，从而促进*Albugo laibachii*的生长。

我们还探讨了GH25同源物在不同真菌中的作用。通过与*Curtobacterium* sp. #2的对抗实验，我们发现来自MbA和*U. maydis*的GH25同源物能够显著抑制*Curtobacterium* sp. #2，而来自*R. solani*的GH25则没有此效果。这表明GH25同源物的靶向特异性可能与进化上的宿主适应有关。此外，我们还发现，与*Curtobacterium* sp. #2和*Albugo laibachii*的相互作用能够显著降低*Albugo laibachii*的感染程度，而这种影响在无菌条件下更为明显。这进一步支持了GH25在抑制*Albugo laibachii*方面的功能。

我们还测试了GH25同源物在不同微生物群落中的作用。在与*Curtobacterium* sp. #2的对抗实验中，我们发现来自MbA和*U. maydis*的GH25同源物能够显著抑制*Curtobacterium* sp. #2，而来自*R. solani*的GH25则没有此效果。这表明GH25同源物的靶向特异性可能与进化上的宿主适应有关。此外，我们还发现，与*Curtobacterium* sp. #2和*Albugo laibachii*的相互作用能够显著降低*Albugo laibachii*的感染程度，而这种影响在无菌条件下更为明显。这进一步支持了GH25在抑制*Albugo laibachii*方面的功能。

通过这些实验，我们揭示了植物病原体与微生物群落之间的复杂相互作用。研究发现，*Albugo laibachii*与*Curtobacterium* sp.等细菌紧密关联，这些细菌在植物感染过程中起着重要作用。此外，GH25对*Curtobacterium* sp.的抑制作用可能是其对抗*Albugo laibachii*的关键机制。同时，我们发现*Curtobacterium* sp. #2能够显著恢复*Albugo laibachii*的感染能力，表明其与*Albugo laibachii*之间存在保护性相互作用。这些结果表明，GH25在调控微生物群落中起着重要作用，可能通过针对特定细菌实现其功能。

在总结中，我们提出了一个模型，描述了由GH25协调的跨界微生物相互作用。我们的研究揭示了酵母MbA、卵菌*Albugo laibachii*和细菌*Curtobacterium* sp. #2之间的三元对抗关系。我们发现，MbA和*Curtobacterium* sp. #2之间存在相互对抗，*Albugo laibachii*则在某种程度上保护*Curtobacterium* sp. #2。这些结果表明，GH25在微生物群落的调控中起着关键作用，其作用可能与宿主适应有关。因此，理解植物病原体与相关微生物之间的竞争机制对于有效控制疾病和恢复植物健康至关重要。