《Biochemical Pharmacology》：Exosomal transfer of VPS9D1-AS1 induces M2 polarization to promote erlotinib resistance of LUAD cells via activation of the Wnt/β-catenin signaling pathway
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肺癌微环境中lncRNA VPS9D1-AS1通过外泌体传递激活Wnt/β-catenin通路诱导M2型巨噬细胞极化，促进非小细胞肺癌对厄洛替尼的耐药。
滕卓然|高金燕|李晨|王淼|李岚|云贺|卢飞|侯宇|夏耀雄|高彦平|张桥
中国云南省昆明市昆明医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系
摘要
肿瘤微环境（TME）被广泛认为是肺腺癌（LUAD）进展中的关键因素。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是TME的主要组成部分。大量证据表明TAMs与LUAD患者的生存率之间存在关联。在本研究中，我们首次证明了长链非编码RNA（lncRNA）VPS9结构域包含1反义RNA 1（VPS9D1-AS1）能够调节LUAD对厄洛替尼的耐药性。本研究旨在探讨外泌体传递的VPS9D1-AS1是否通过与TAMs相互作用而影响LUAD对厄洛替尼的耐药性。研究发现，VPS9D1-AS1能够诱导M2型巨噬细胞的极化。此外，我们还证实外泌体传递的VPS9D1-AS1通过招募MYCN反义链（NCYM）来促进糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的泛素化及降解，从而激活Wnt/β-连环蛋白通路。同时，VPS9D1-AS1还能隔离miR-532-3p，上调β-连环蛋白1（CTNNB1）的表达。综上所述，外泌体传递的VPS9D1-AS1通过激活Wnt/β-连环蛋白通路，诱导M2型巨噬细胞的极化，进而促进LUAD细胞的厄洛替尼耐药性。
引言
肺癌的五年生存率仅为5%，是全球癌症相关死亡的主要原因[1]。非小细胞肺癌（NSCLCs）作为肺癌的主要亚型，占所有肺癌病例的近80%[2]。肺腺癌（LUAD）是最常见的NSCLC组织学亚型[3]。LUAD患者通常在疾病晚期出现转移[4]。目前的治疗策略远未达到理想效果[5]。因此，迫切需要发现更多有前景的生物标志物来改善LUAD患者的预后。
肿瘤微环境（TME）在LUAD的发生和发展中的生物学作用已得到研究[6]。有研究表明，LUAD细胞与TME成分之间的相互作用促进了LUAD的恶性进展并导致治疗耐药性[7]。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是TME的主要组成部分，其与LUAD的病情密切相关[8]。已知巨噬细胞在受到不同刺激时会极化为M1型或M2型[9]。M1型巨噬细胞具有抗肿瘤活性，而M2型巨噬细胞则能促进肿瘤发展，表现为促进LUAD细胞的增殖、迁移并形成免疫抑制性微环境[10]。因此，阐明LUAD细胞与巨噬细胞之间的相互作用机制对于LUAD的治疗具有重要意义。
长链非编码RNA（lncRNAs）的蛋白质编码能力较弱，长度通常超过200个核苷酸[11]。随着对lncRNAs功能的深入认识，越来越多的证据表明它们在恶性肿瘤的生理和病理过程中起着重要作用[12]。在LUAD及其他多种癌症中均发现了lncRNAs的失调[13]。lncRNAs参与LUAD细胞的增殖、凋亡、迁移和药物耐药性的调控[14]。目前尚需进一步研究lncRNAs如何调节LUAD细胞与TAMs之间的相互作用。我们已经证明lncRNA VPS9结构域包含1反义RNA 1（VPS9D1-AS1）能够调节LUAD对厄洛替尼的耐药性，但其其他调控机制仍有待探索。
外泌体来源于多囊体，直径范围为30至150纳米[15]。外泌体的分泌和摄取是细胞间的一种通讯方式，其中包含蛋白质、脂质以及编码或非编码RNA[16]。最近的研究表明，来自化疗敏感/耐药细胞的外泌体中的基因可能影响受体细胞的化疗反应[17]。此外，外泌体中的成分可作为评估肿瘤患者药物反应的生物标志物[18]。因此，研究癌细胞产生的外泌体调控癌症进展的机制至关重要。
Wnt/β-连环蛋白通路在许多癌症的发病和发展中起着关键作用[19]。β-连环蛋白的异常激活通常会促进肿瘤进展[20]。糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）是Wnt/β-连环蛋白通路的负调控因子，位于该通路的下游，能够抑制其过度激活[21]。此外，Wnt/β-连环蛋白通路的激活被认为是M2型巨噬细胞极化的诱导因素[22]。
本研究进一步探讨了外泌体传递的lncRNA VPS9D1-AS1是否通过与TAMs相互作用而影响LUAD对厄洛替尼的耐药性。
实验方法
细胞培养
LUAD细胞（HCC827和HCC4006）及人单核细胞系T-淋巴细胞Human Peripheral blood-1（THP-1）在RPMI-1640培养基（Gibco，加利福尼亚州卡尔斯巴德）中培养。人胚胎肾细胞（HEK293T）在DMEM培养基（Gibco，加利福尼亚州卡尔斯巴德）中培养。所有使用的细胞均来自美国弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection）。为了建立厄洛替尼耐药的LUAD细胞，我们在HCC827和HCC4006细胞的培养基中添加了特定浓度的厄洛替尼。与厄洛替尼耐药的LUAD细胞共培养可诱导巨噬细胞极化为M2型
VPS9D1-AS1是一种新发现的致癌lncRNA，在某些人类癌症中存在，其在厄洛替尼耐药LUAD细胞中的作用及具体机制仍有待研究。在之前的功能实验中，我们发现沉默VPS9D1-AS1可显著降低LUAD细胞对厄洛替尼的IC50值（图1A）。HCC827R细胞中厄洛替尼的IC50值从对照组的2.58 μMol/L降低到两个独立实验组中的0.46 μMol/L和0.55 μMol/L。
讨论
近期研究表明，外泌体通过传递RNA和蛋白质在细胞间进行通讯，这对体内微环境的形成至关重要[24]。我们之前的研究已经证明，外泌体传递的lncRNA VPS9D1-AS1能够调节LUAD的进展和厄洛替尼耐药性。本研究进一步证实，VPS9D1-AS1通过激活Wnt/β-连环蛋白通路，诱导LUAD细胞的M2型极化并增强其对厄洛替尼的耐药性。
作者贡献声明
滕卓然：撰写初稿。高金燕：撰写初稿。李晨：数据整理。王淼：数据可视化。李岚：数据可视化。云贺：数据可视化。卢飞：数据可视化及验证。侯宇：撰写、审稿与编辑。夏耀雄：撰写、审稿与编辑、资金申请。高彦平：项目管理。张桥：项目监督与管理。
伦理审批与参与同意
本研究未涉及人类或动物实验。
出版同意
该手稿已获得所有作者的批准。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了云南省基础研究项目（编号202301AT070189、202401AY070001-150、202401AY070001-304）、国家自然科学基金（编号82460510、82203565）以及云南省应用研究基金（编号202201AY070001）的支持。
