《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects》：Pharmacological inhibition of
Trypanosoma cruzi aldo-keto reductase (
TcAKR) and its effect on benznidazole resistance
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本研究评估了槲皮素、氟芬酸等化合物对TcAKR酶的抑制效果，通过分子对接和酶动力学实验发现，两者以非竞争机制抑制酶活性，并证实抑制TcAKR可逆转伯氨喹啉耐药性，为提高药物治疗方案提供新策略。
帕特里夏·安德烈亚·加拉瓦利亚（Patricia Andrea Garavaglia）|塞巴斯蒂安·阿杜维里（Sebastián Aduviri）|巴勃罗·特鲁希略（Pablo Trujillo）|劳拉·莫妮卡·塔索（Laura Mónica Tasso）|华金·胡安·鲍蒂斯塔·卡纳塔（Joaquín Juan Bautista Cannata）|莫妮卡·皮克霍尔兹（Monica Pickholz）|加布里埃拉·安德烈亚·加西亚（Gabriela Andrea García）
阿根廷国家寄生虫学研究所“马里奥·法塔拉·查本博士”（National Institute of Parasitology “Dr. Mario Fatala Chaben”）- 安纳利斯国家卫生实验室“卡洛斯·G·马尔布兰博士”（ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”），地址：Paseo Colón大道568号，布宜诺斯艾利斯1063
摘要 查加斯病（Chagas disease）由原生动物克鲁兹锥虫（Trypanosoma cruzi 引起，由于全球化程度的增加，已成为一个全球性的健康问题。多项研究表明，克鲁兹锥虫 中的醛酮还原酶（TcAKR ）与苯尼达唑（benznidazole）的耐药性有关，而苯尼达唑是治疗这种感染常用的药物。
为了进一步证实TcAKR 在药物耐药性中的作用，我们评估了它与四种化合物的相互作用——槲皮素（quercetin）、氟芬那酸（flufenamic acid）、酚酞（phenolphthalein）和甲萘醌（menadione）——这些化合物此前已被报道为其他醛酮还原酶的抑制剂。通过分子对接技术评估了它们的亲和力及分子特异性相互作用，并实验测定了这些化合物对TcAKR 两种活性（醛酮还原酶和醌氧化还原酶）的抑制效果。
结合亲和力从高到低排序为：槲皮素 > 氟芬那酸 > 酚酞 > 甲萘醌。槲皮素和氟芬那酸都与酶活性位点外的氨基酸残基发生相互作用。槲皮素完全抑制了TcAKR 的两种活性，而氟芬那酸的抑制效果约为50%。酚酞和甲萘醌的抑制作用较弱。槲皮素和氟芬那酸的抑制机制属于非竞争性抑制。
在过表达TcAKR 的转染寄生虫中评估了槲皮素对苯尼达唑耐药性的影响，这些寄生虫对苯尼达唑的耐药性提高了1.8倍。槲皮素处理后，寄生虫对苯尼达唑的敏感性恢复到与对照组相当的水平。这些结果进一步证明了TcAKR 在苯尼达唑耐药性中的作用，并表明抑制TcAKR 可以提高治疗效果。
引言 查加斯病是一种由克鲁兹锥虫 引起的美洲地方性寄生虫感染，是一个重大的公共卫生问题。在流行地区，克鲁兹锥虫 通过锥蝽（triatomine bugs）传播；然而，它也可以通过非媒介途径传播，如垂直传播、经口传播、输血和器官移植。据估计，全球有600万至700万人患有查加斯病，其中约30%的病例会发展成可能致命的心脏或消化系统并发症[1,2]。
目前，克鲁兹锥虫 感染的治疗仅限于两种硝基杂环化合物：苯尼达唑（Benznidazole，简称Bz）和尼福替莫克斯（Nifurtimox，简称Nx）[3]。尽管在急性期进行病因治疗最为有效，但证据表明，即使在血清转化率较低的情况下，它也能减轻慢性期的寄生虫负担[4]。然而，这两种药物都有重要的缺点，因为它们经常会引起不良反应，并且已经出现了耐药性的克鲁兹锥虫 菌株[5,6]。
因此，寻找查加斯病的替代治疗策略仍然是一个关键的研究领域。
克鲁兹锥虫 中的醛酮还原酶（TcAKR ）参与Bz和Nx的代谢[7][8][9][10]。TcAKR 是一种依赖NADPH的还原酶，除了具有醛酮还原酶活性外，还表现出针对ο-NQs的醌氧化还原酶（QOR）活性[11]。关于Bz，研究表明，一些天然耐Bz的克鲁兹锥虫 菌株表现出较高的TcAKR 表达[8]。此外，过表达这种酶的转染前体鞭毛体（epimastigotes）对Bz的抑制浓度（IC50 ）比对照组高50%[7,8]。这些发现表明抑制TcAKR 可以提高克鲁兹锥虫 对Bz的敏感性。
为了验证这一假设，我们选择了四种先前被报道为其他醛酮还原酶抑制剂的化合物——槲皮素、氟芬那酸、酚酞和甲萘醌[12,13]——并通过分子对接研究评估了它们与TcAKR 的亲和力和相互作用。随后通过生化实验评估了它们抑制重组TcAKR 酶的能力。根据这些结果，槲皮素和氟芬那酸被认为是最有前景的候选抑制剂，并通过酶动力学分析进一步证实了它们的非竞争性抑制机制。最后，在过表达TcAKR 的转染寄生虫中评估了槲皮素对Bz耐药性的影响。槲皮素能够降低这些寄生虫对Bz的IC50 值，支持了抑制TcAKR 可以提高Bz治疗效果的假设。
分子对接 分子对接 使用
TcAKR 的氨基酸序列（GenBank登录号
EU558869 ）通过AlphaFold生成了一个结构模型。Trujillo等人[14]利用该模型进行了1微秒（1 μs）的分子动力学（MD）模拟。然后通过AmberTools的
cpptraj 模块对MD轨迹进行聚类分析，选出了一个代表性的
TcAKR 构象，作为对接计算的受体结构。配体结构为槲皮素（quercetin）
TcAKR 与已知能抑制其他醛酮还原酶的化合物的分子对接选择具有最高fpocket得分的结合口袋进行对接。该口袋包含18个残基（W24、D48、F52、Y53、K78、W80、H111、W112、P113、N141、Q162、E164、W188、K234、H272、P273、D274和F276），如图1所示。其中，D48、Y53、K78和H111构成了活性位点的催化四元组[20]。该口袋的成药性得分为0.91（0-1分），表明它是对接计算的主要目标。
随后进行了分子对接
讨论 克鲁兹锥虫 感染的药物耐药性是全球根除查加斯病的主要障碍之一。对于Bz而言，尽管耐药性是一个多因素现象，但已确定几种寄生虫酶可能参与其中，包括TcAKR 。多种实验证据支持TcAKR 参与Bz代谢：该酶对Bz具有亲和力[21]，CL Brener菌株变体表现出Bz还原酶活性
CRediT作者贡献声明 帕特里夏·安德烈亚·加拉瓦利亚（Patricia Andrea Garavaglia）： 撰写——审阅与编辑、初稿撰写、方法学设计、研究实施、资金获取、数据分析、概念构建。塞巴斯蒂安·阿杜维里（Sebastián Aduviri）： 撰写——审阅与编辑、初稿撰写、方法学设计、研究实施。巴勃罗·特鲁希略（Pablo Trujillo）： 方法学设计、研究实施。劳拉·莫妮卡·塔索（Laura Mónica Tasso）： 撰写——审阅与编辑、方法学设计、研究实施。华金·胡安·鲍蒂斯塔·卡纳塔（Joaquín Juan Bautista Cannata）： 撰写——审阅与编辑、数据分析、概念构建。莫妮卡·皮克霍尔兹（Monica Pickholz）：
利益冲突声明 作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究工作。
致谢 本工作得到了阿根廷国家科学技术研究委员会（CONICET）[资助编号PIP 11220210100356CO（授予加布里埃拉·加西亚）和PIP 11220220100493CO（授予莫妮卡·皮克霍尔兹）]、阿根廷国家卫生实验室与研究所管理局（ANLIS）[资助编号FOCANLIS-2017（授予帕特里夏·加拉瓦利亚）以及阿根廷科学技术与生产创新部（MINCyT）[资助编号PICT-2019-02108（授予莫妮卡·皮克霍尔兹）]的支持。
