1,2,3-三唑修饰的索拉非尼衍生物在肝细胞癌中可诱导DNA损伤、细胞凋亡以及PI3K/AKT通路的抑制：设计、合成与评价

《Bioorganic Chemistry》：1,2,3-Triazole-modified sorafenib derivatives induce DNA damage, apoptosis, and PI3K/AKT pathway suppression in hepatocellular carcinoma: Design, synthesis, and evaluation

本研究通过分子杂交策略，以索拉非尼为母核，引入1,2,3-三唑环取代基，合成了系列衍生物。体外实验显示化合物12e、12g和12j对HepG2细胞增殖抑制显著（IC50分别为6.49±0.17、6.53±1.27、7.21±0.30 μM）。机制研究证实其通过DNA损伤、ROS升高及线粒体凋亡途径抑制肿瘤。体内实验表明12e和12g能有效抑制荷瘤小鼠肿瘤生长且毒性低，提示三唑修饰索拉非尼衍生物有望作为肝癌靶向治疗新药。

　　肝癌是全球范围内导致癌症死亡的主要原因之一，其中肝细胞癌（HCC）是最常见的原发性肝癌类型。尽管在治疗策略上取得了进展，但晚期HCC的5年生存率仍低于10%，且治疗选择依然有限。目前，索拉非尼（Sorafenib）是用于晚期HCC系统治疗的多激酶抑制剂，其主要作用机制是通过抑制Ras/Raf/MAPK信号通路、血管内皮生长因子受体（VEGFR）和FLT3等靶点，从而阻断肿瘤细胞的增殖和血管生成。然而，索拉非尼的临床效果受到获得性耐药、不良反应和靶点选择性不足等因素的限制，这促使研究人员不断探索下一代更具疗效和更低耐药性的分子。

为了解决这些问题，研究团队采用了一种分子杂交策略，设计并合成了系列新型索拉非尼衍生物，这些衍生物引入了1,2,3-三唑基团。1,2,3-三唑是一类具有刚性和平面结构的五元杂环化合物，能够通过疏水作用、范德华力和氢键等多种机制与不同的生物靶点结合。它们在抗癌领域展现出广泛的应用潜力，尤其是在诱导DNA损伤和线粒体介导的细胞凋亡方面。研究中，团队保留了索拉非尼的N,N-二苯基脲核心结构（A和B环），并将原来的C环吡啶结构替换为不同取代基的1,2,3-三唑衍生物。这一策略旨在通过结构优化，提升化合物的抗肿瘤活性，同时降低毒副作用。

在合成过程中，研究团队以4-三氟甲基苯基异氰酸酯（化合物9）为起始原料，通过酰胺缩合反应与3-氨基苯基乙炔或4-氨基苯基乙炔反应，得到终端炔烃中间体（化合物10和11）。随后，这些中间体通过铜催化的叠氮-炔烃环加成反应（CuAAC）与多种具有不同取代基的叠氮衍生物反应，生成一系列含有1,2,3-三唑基团的索拉非尼衍生物。该方法不仅提高了合成效率，还确保了目标化合物的结构多样性，从而为后续的生物活性评估提供了丰富的样本。

为了评估这些新型索拉非尼衍生物的抗肿瘤潜力，研究团队使用CCK-8实验检测了30种化合物对HepG2肝癌细胞增殖的影响。实验中，HepG2细胞被接种在96孔板中，培养24小时后，每孔加入不同浓度的化合物或等体积的溶剂作为对照。经过72小时的处理后，加入CCK-8试剂，孵育0.5至1小时，最后通过比色法测定细胞存活率。结果显示，化合物12e、12g和12j在10 μM浓度下对HepG2细胞的增殖具有显著的抑制作用，其半数抑制浓度（IC??）分别为6.49 ± 0.17 μM、6.53 ± 1.27 μM和7.21 ± 0.30 μM，表明这些化合物在体外表现出良好的抗肿瘤活性。

进一步的生物学评估揭示了这些化合物对肿瘤细胞的多重作用机制。首先，它们显著抑制了HepG2细胞的集落形成和迁移能力，这表明它们不仅能够阻止肿瘤细胞的增殖，还能有效抑制其侵袭和转移能力。其次，这些化合物能够提高细胞内的活性氧（ROS）水平，ROS的积累被认为是诱导细胞凋亡的重要因素之一。通过DAPI染色、Annexin V/PI流式细胞术、TUNEL检测等方法，研究团队证实了这些化合物能够诱导线粒体介导的细胞凋亡，并造成DNA损伤。此外，Western blot分析结果显示，这些化合物能够显著上调促凋亡蛋白（如Bax、cleaved-caspase-3/9和cleaved-PARP）的表达，同时下调抗凋亡蛋白Bcl-2的水平，从而促进细胞凋亡过程。

在DNA损伤方面，研究团队检测了p-H2AX蛋白的表达情况。p-H2AX是DNA双链断裂的重要标志物，其表达水平的升高意味着DNA损伤的发生。结果表明，化合物12e、12g和12j能够显著激活p-H2AX蛋白，进一步支持其诱导DNA损伤的能力。此外，这些化合物还能够抑制PI3K/AKT信号通路的活性，PI3K/AKT通路在肿瘤细胞的存活、增殖和转移中起着关键作用，其抑制有助于增强抗肿瘤效果。

为了验证这些化合物在体内的抗肿瘤效果，研究团队在HepG2异种移植小鼠模型中进行了实验。实验结果显示，化合物12e和12g能够有效抑制肿瘤的生长，且未表现出明显的全身毒性。通过测量肿瘤体积和重量、器官指数、血清转氨酶水平以及组织学评估，研究团队确认了这些化合物的安全性。这表明，1,2,3-三唑修饰的索拉非尼衍生物不仅在体外表现出良好的抗肿瘤活性，而且在体内也具有一定的治疗潜力。

这些研究结果表明，通过引入1,2,3-三唑基团，索拉非尼的结构得到了有效优化，从而提升了其抗肿瘤活性并降低了毒副作用。化合物12e、12g和12j作为新型索拉非尼衍生物，展示了作为肝癌治疗候选药物的前景。此外，1,2,3-三唑基团的引入不仅改善了药物的分子特性，还为后续的结构优化和药物开发提供了新的思路。

在药物开发过程中，分子杂交策略被广泛应用于提高化合物的生物活性和药理特性。通过将两个或多个具有相似或互补生物活性的药效团共价连接，可以创造出具有更优性能的新型分子。这种策略的优势在于能够结合母体结构的优点，从而改善药物的疗效、减少毒性、增强溶解性、提高代谢稳定性，并延长药物的半衰期。因此，1,2,3-三唑基团的引入为索拉非尼的结构优化提供了新的方向，同时也为其他抗癌药物的设计和开发提供了参考。

研究团队在合成过程中使用的材料和试剂包括：索拉非尼衍生物由团队自行合成；二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma-Aldrich公司；Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）购自LifeTech公司；胎牛血清（FBS）购自Gibco公司；CCK-8检测试剂盒、DAPI染色液、结晶紫染色液、活性氧检测试剂盒、HE染色试剂盒等均购自Biosharp公司；GPT和GOT（丙氨酸氨基转移酶和天门冬氨酸氨基转移酶）购自南京某公司。这些试剂和材料的选择确保了实验的准确性和可重复性。

在统计分析方面，研究团队使用GraphPad 7.0软件进行数据处理，所有数据均以均值±标准误（SEM）表示。为了评估显著性差异，研究团队采用了双尾Student's t检验或单因素方差分析（ANOVA）后进行Student-Newman-Keuls（SNK）检验。这种统计方法能够有效地判断不同组别之间的差异是否具有统计学意义，从而为实验结果的可靠性提供支持。

研究团队在实验过程中遵循了伦理规范，动物实验已通过河南科技大学实验室动物福利和伦理审查委员会的批准（HAUST-024-M081001）。此外，研究团队声明他们没有已知的与本研究相关的竞争性财务利益或个人关系，确保了研究的客观性和公正性。

本研究得到了河南省重点科研项目基础研究计划（项目编号：23ZX006）和2023年河南省中央引导地方科技发展基金支持项目（项目编号：Z20231811030）的资助。这些支持为研究提供了必要的资源和条件，使得实验能够顺利进行并取得有价值的成果。

总体而言，这项研究通过分子杂交策略，设计并合成了系列新型索拉非尼衍生物，成功提升了其抗肿瘤活性并降低了毒副作用。化合物12e、12g和12j在体外和体内均表现出良好的抗肿瘤效果，显示出作为肝癌治疗候选药物的潜力。未来，这些化合物有望进一步开发为靶向治疗药物，为肝癌患者提供更有效的治疗方案。同时，这项研究也为其他抗癌药物的设计和开发提供了重要的理论依据和实验支持。