《Developmental Biology》：A zebrafish
rbm24a-GFP knock-in line for monitoring lineage-specific dynamic protein expression and function
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本研究构建了斑马鱼rbm24a-GFP敲入系，通过荧光蛋白标记系统动态追踪Rbm24a在胚胎及成体组织中的时空表达与细胞定位规律。发现该蛋白在晶状体纤维细胞和内耳毛细胞前体中呈胞质特异性分布，并在心肌细胞分化过程中呈现动态核质穿梭现象。利用zGrad系统成功实现GFP-Rbm24a的条件性降解，验证了该模型对心脏发育缺陷及心肌完整性破坏的模拟能力，为解析RNA结合蛋白的时空定位调控机制提供了新型工具载体。
应子薇|张一壮|奥黛丽·萨凯特|邵明|史德莉|拉斐尔·格里福内
索邦大学，巴黎-塞纳生物研究所（IBPS），CNRS UMR 8263，INSERM U1345，发展、适应与衰老研究，法国巴黎
摘要
RNA结合蛋白Rbm24在进化上具有保守性，其编码基因在脊椎动物中表现出组织特异性表达。然而，该蛋白在不同细胞谱系中的动态定位仍不清楚。我们构建了一个斑马鱼rbm24a-GFP敲入系，在该系中内源性Rbm24a被GFP标记，从而能够精确监测并系统地描述其在发育过程中及成年后的时空表达和亚细胞定位情况。Rbm24a-GFP不仅在某些特定组织中表达强烈受限，还表现出细胞类型和发育阶段的特异性亚细胞定位模式。该蛋白主要定位于晶状体纤维细胞和感觉毛细胞前体的细胞质中。在肌母细胞和心肌母细胞分化过程中，它会从细胞质转移到细胞核。我们进一步验证了这一敲入系在抑制Rbm24a功能方面的有效性。使用zGrad系统对Rbm24a-GFP进行靶向降解后，产生了合子rbm24a突变体或形态异常个体，表现为心脏形态发生缺陷和心肌结构破坏。因此，这一系对于理解Rbm24a-GFP在稳态和病理条件下的动态表达及定位变化具有特别重要的价值。同时，它也丰富了斑马鱼敲入系的资源库，并为通过degron介导的条件性降解来研究该蛋白的功能提供了便捷工具。
引言
RNA结合蛋白（RBPs）是转录后基因表达的关键调节因子，有助于增加蛋白质组的多样性并调节细胞内的蛋白质丰度（Gebauer等人，2021年；Glisovic等人，2008年）。RNA结合基序蛋白24（Rbm24）是一种进化上保守的RBP，在脊椎动物胚胎中表现出高度受限的表达模式（Grifone等人，2020年；Shi等人，2025a年）。来自不同动物模型的有限表达分析数据显示，Rbm24在参与分化过程的多种细胞类型中均有表达，包括骨骼肌、心肌细胞、内耳感觉毛细胞、晶状体纤维细胞和嗅觉受体神经元（Fetka等人，2000年；Grifone等人，2014年、2018年；Maragh等人，2011年、2014年；Miller等人，2008年；Poon等人，2012年；Saquet等人，2025年；Xu等人，2009年）。Rbm24作为一种多功能的转录后调节因子，可促进mRNA稳定性、环状RNA的生物合成以及肌肉特异性外显子包含，从而调节骨骼肌的分化和再生（Cardinali等人，2016年；Grifone等人，2021年；Jin等人，2010年；Yang等人，2014年；Zhang等人，2020年），同时维持心肌的结构和功能（Liu等人，2019年、2022年、2025年；Yang等人，2014年；Zhang等人，2016年）。在头部感觉器官中，Rbm24调节crystallinmRNA的poly(A)尾长度和翻译效率，促进晶状体纤维的分化（Shao等人，2020年），并促进毛细胞特异性基因的可变剪接，有助于维持内耳形态发生和毛细胞功能（Cheng等人，2020年；Wang等人，2023年；Zheng等人，2021年）。这些研究表明，Rbm24执行着与发育阶段和组织特异性相关的转录后调节功能，这些功能可能依赖于其时空表达和亚细胞定位模式。然而，Rbm24的不同活性与其从胚胎到成年的动态表达和定位之间的关联仍不明确。
斑马鱼胚胎因其透明性和体外发育特性，成为观察GFP标记蛋白在谱系分化过程中动态表达和定位的理想模型。斑马鱼基因组中有两个rbm24同源基因：rbm24a和rbm24b，后者可能是由基因组复制产生的。rbm24a与其他脊椎动物Rbm24同源基因具有最高的整体一致性及相同的表达模式，而rbm24b主要在体节中表达（Grifone等人，2014年；Maragh等人，2014年；Saquet等人，2025年）。为了精确追踪斑马鱼Rbm24a在发育过程中及成年组织中的谱系特异性表达和动态亚细胞定位，我们最近构建了一个敲入系，在rbm24a编码区插入了GFP报告基因序列（Zhang等人，2025年）。在本研究中，我们详细描述了Rbm24a-GFP在胚胎和成年组织中的表达和亚细胞定位情况。此外，利用zGrad系统对GFP标记蛋白进行靶向降解（Yamaguchi等人，2019年），我们发现早期胚胎中Rbm24a的敲低会再现合子突变体或形态异常个体的表型，表现为心脏形态发生缺陷和心肌纤维完整性受损（Maragh等人，2011年；Poon等人，2012年；Saquet等人，2025年；Shao等人，2020年）。因此，这一敲入系对于进一步研究Rbm24a在发育过程及成年后的表达和功能非常有用。
实验方法
内源性Rbm24a-GFP信号再现了rbm24a转录本的表达模式
我们通过基于内含子的基因组编辑策略，将GFP序列插入内源性rbm24a编码区的3'端，创建了rbm24a-GFP敲入系（Li等人，2015年；Zhang等人，2025年）。尽管GFP和Rbm24a的蛋白质大小相当，但C端标记有GFP的Rbm24a仍具有完全的功能，因为敲入胚胎的发育正常，且敲入株与野生型在形态（图A–C’）和存活率上没有差异
讨论
本研究利用新构建的rbm24a-GFP敲入系，详细分析了Rbm24a-GFP在胚胎和成年组织中的表达和定位情况。总体而言，Rbm24a-GFP信号不仅再现了内源性rbm24a转录本的表达模式，还以更高的灵敏度精确揭示了Rbm24a的时空积累情况。值得注意的是，我们观察到Rbm24a主要定位于晶状体纤维和感觉毛细胞前体细胞的细胞质中
伦理声明
所有实验均遵循欧洲关于科学用途动物保护的指令210/63/EU，并符合法国的“Décret 2013-118”规定。该鱼类实验设施已获得法国“动物保护与健康服务”的批准（批准编号B-75-05-25）。
斑马鱼饲养
成年动物在标准饲养系统中饲养，光照时间为14小时，黑暗时间为10小时。早期胚胎和幼体在28°C下培养，使用E3培养基（5 mM NaCl，0.17 mM
CRediT作者贡献声明
史德莉：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿撰写，可视化，验证，监督，资源提供，项目管理，方法学研究，资金申请，概念构思。张一壮：撰写 – 审稿与编辑，研究。应子薇：撰写 – 审稿与编辑，研究。邵明：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿撰写，可视化，验证，监督，资源提供，项目管理，方法学研究，资金申请
资助
本研究得到了法国肌肉萎缩症协会（AFM-Téléthon，资助编号23545）、国家自然科学基金（资助编号32570956、32170816、32370860和32450630）、山东大学杰出中青年学者计划以及山东省泰山学者计划的支持。
致谢
我们感谢索邦大学IBPS水生平台提供的鱼类护理支持，感谢IBPS成像设施的France Lam和Chloé Chaumeton，以及山东大学生命科学学院核心设施和服务平台的Jianlin Shen、Yiteng Xu和Qingqing Wei在成像方面提供的帮助。
