从土壤宏基因组中克隆、表达、纯化并鉴定超氧化物歧化酶

《Recent Advances in Anti-Infective Drug Discovery》：Cloning, Expression, Purification, and Characterization of Superoxide Dismutase from the Soil Metagenome

超氧化物歧化酶（SOD）催化有毒自由基转化为无毒形式，本研究从花园土壤中提取DNA，通过PCR扩增、克隆表达及Ni-NTA纯化获得重组SOD，证实其活性最适40°C和pH 8，耐热性达3小时，且在50-60°C下活性衰减50%。圆二色光谱和Trp荧光证实其二级结构稳定，分子模拟显示构象在pH变化下保持稳定，与芽孢杆菌Mn SOD高度相似。Mn2?结合位点为酶工程改造提供新靶点。

　　

摘要

引言：超氧化物歧化酶（SOD）是一种能够将应激条件下产生的有毒自由基转化为无毒形式的酶。因此，这种酶有助于微生物在各种环境条件下的适应和生存，使其在应对应激过程中成为不可或缺的生物催化剂。在本研究中，我们着手从花园土壤中提取DNA，并从中分离出超氧化物歧化酶（SOD），该土壤的平均温度范围为4°C至45°C。

材料与方法：使用试剂盒提取了宏基因组DNA，通过PCR技术扩增目标基因。扩增后的PCR产物经过凝胶分离后，被克隆到pGEMT-easy载体中，随后再亚克隆到表达载体中。蛋白质通过Ni-NTA色谱法进行纯化，并通过生物物理、生物化学及计算方法进行表征。

结果：重组SOD得到了表达和纯化；纯化后的蛋白质在较宽的pH值和温度范围内均表现出活性，其最佳活性分别出现在40°C和pH 8时。该酶在40°C下可保持3小时的稳定性，但在50°C和60°C下孵育3小时后活性会下降50%。生物物理研究表明，蛋白质的二级结构保持稳定，这一点通过圆二色光谱和色氨酸（Trp）荧光实验得到了证实。序列及结构分析显示，本研究中的SOD与多株芽孢杆菌属（Bacillus）中的Mn SOD具有高度相似性。分子模拟动力学实验表明，蛋白质结构在不同pH值下仍具有较高的构象稳定性，说明该酶在较宽的pH范围内都能发挥作用。

讨论：本研究全面分析了从土壤宏基因组中获得的超氧化物歧化酶的结构与功能。研究中鉴定出的Mn²⁺结合位点为进一步改造和设计突变型SOD提供了可能性。

结论：该酶具有重要的工业应用价值。由于SOD在不同pH值和温度条件下都具有广泛的活性，因此可以针对其潜在的工业应用进行优化，包括治疗用途，从而为开发新型抗氧化疗法和生物催化剂开辟新的途径。

关键词： 超氧化物歧化酶、宏基因组学、氧化应激、活性氧、生物催化剂设计、分子模拟。