转录组学分析和WGCNA（加权基因计数网络分析）为春季兰花（Cymbidium goeringii）花朵中的花青素代谢提供了新的见解，这些发现有望应用于未来的工业领域
《Infant Behavior and Development》：Transcriptomics profiling and WGCNA provide new insights into anthocyanin metabolism in spring orchid (
Cymbidium goeringii) flowers for future industrial applications
干旱胁迫严重限制了农业和林业的生产力，因此识别关键调控基因或模块，并阐明其分子机制，对于培育抗旱作物至关重要。本研究选择了来自“中雄”系列的三个杨树品种（ZX3、ZX4 和 ZX5），它们在抗旱性上表现出显著差异，通过整合微小RNA（miRNA）和转录组测序分析，预测了266个miRNA-mRNA相互作用，其中66个miRNA和86个目标基因表现出显著的抗旱响应；大多数目标基因编码转录因子（TFs）。值得注意的是，36个miRNA靶向55个TFs显示出显著的差异表达，暗示了miR156–SPL和miR156–NF-Y等模块在抗旱反应中的作用。在高度耐旱的ZX4中，miR156g在干旱条件下显著上调，同时其靶标PagSPL1B的表达受到抑制，而miR156g在敏感的ZX3和ZX5中则没有显著变化。双荧光素酶实验确认了miR156g直接切割PagSPL1B mRNA。转基因84K杨树过表达PagSPL1B表现出比野生型更高的干旱敏感性，表现为叶片萎蔫加剧、相对含水量降低、活性氧（ROS）积累增加、渗透调节物质（脯氨酸和可溶性糖）水平下降，以及PSII和PSI活性显著受损。这些结果表明，PagSPL1B通过削弱渗透调节、抗氧化能力和光保护，负向调控杨树的抗旱性。本研究首次揭示了miR156g通过靶向抑制PagSPL1B来正向调控杨树的抗旱适应性，为杨树抗旱性遗传改良提供了新的分子靶点。
在面对全球变暖的背景下，干旱已成为影响作物生长和农业生产力的最致命环境因素之一。近年来，干旱导致全球作物产量减少的累计估计达到至少40%。当植物受到干旱胁迫时，它们通过协调调控机制在形态、生理和分子层次上启动复杂的适应性反应。植物的抗旱性受到多种机制的调控，包括生理、生化、遗传和表观遗传因素。这些机制包括渗透调节、抗氧化防御系统、激素合成、信号转导通路的激活、DNA甲基化以及应激相关基因的上调。在这些调控过程中和通路中，转录后基因沉默（PTGS）被广泛认为是维持细胞和分子稳态的关键机制。在干旱条件下，miRNA在调控基因表达方面的重要性日益受到关注。
近年来，许多保守的miRNA已被鉴定为协调干旱适应的调控因子。例如，在水稻中，miR396a的过表达通过抑制两个GRF基因来降低干旱耐受性，导致气孔发育异常。miR393通过影响叶片大小和形态来调控杨树对干旱胁迫的耐受性，影响了干旱胁迫适应性。在水分不足条件下，miR397的靶标β-果糖苷酶参与了CO?固定和能量供应。此外，miRNA广泛参与植物激素信号通路中对干旱适应性的调控。miR169通过调控ABA信号中的核转录因子Y（NF-Y）参与了干旱胁迫的响应。miR160通过调控苹果中的ARF17和核心生长素信号相关转录因子来影响干旱反应。此外，miRNA还参与了赤霉素（GA）信号通路，其中miR477家族预测靶向GRAS家族转录因子SCARE-CROW-LIKE（SCL）。
miRNA通过多种机制调控植物的抗旱性，包括叶片发育、气孔运动、光合作用、植物激素信号和ROS清除。在干旱胁迫下，植物的不同细胞区域会出现ROS的过度积累，而miRNA可以通过调控抗氧化系统来调节干旱适应性。例如，从小麦中获得的Tae-miR9674a在烟草中的过表达通过增强ROS解毒相关基因（如NtFeSOD、NtCAT1和NtPOD4）以及脯氨酸合成基因Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶1（P5CS1）的表达，调节了气孔运动。此外，miR408和miR6427通过调控氧化还原信号来调节ROS稳态和抗旱性。在抗旱水稻中，miR528和miR398靶向铜蛋白转录本，参与氧化应激，且在干旱条件下上调。
在各种参与胁迫反应的miRNA中，miR156在不同物种中高度保守。其靶标SPL基因已被鉴定为植物特异性的转录因子，miR156的结合位点位于编码区或非翻译区（UTRs）。miR156可以被多种非胁迫因素诱导，包括干旱、高温、低温、盐胁迫和营养缺乏。在拟南芥中，miR156通过转录后调控16个AtSPL转录因子中的10个。这种保守的miR156-SPL调控网络对于协调植物发育转换和胁迫反应至关重要。miR156- SPL模块在调控根系和分枝发育、营养阶段变化、开花等发育过程方面起着关键作用。此外，该模块在响应环境刺激方面也发挥着重要作用。miR156的表达在干旱条件下是应答的，并且调控了植物的抗旱性。在苜蓿中，miR156和其靶标SPL13通过改变根结构、水分保持能力和光合参数调控抗旱性。此外，miR156通过调控SPL13和WD40–1增强了花青素合成，这与其他应激缓解代谢物和生理反应相结合，提高了抗旱性。
相反，敲除或敲减OsSPL10会诱导水稻中气孔的快速关闭，从而提高抗旱性。在苹果中，miR156a的过表达会降低盐胁迫耐受性，而其下游靶标MdSPL13则作为盐胁迫适应性的正向调节因子。miR156通过调控ABA信号通路参与番茄的抗旱性，而木薯的miR156-SPL9通过调控茉莉酸（JA）信号通路影响抗旱性。水稻miR156k在冷胁迫下下调，并通过抑制OsSPL14的表达降低了水稻的冷胁迫耐受性。
杨树作为一种重要的造林和木材生产树种，具有快速生长、显著的经济和生态价值。在全球范围内，干旱是限制杨树生长和林地生产力的主要环境因素。提高杨树的抗旱性和抗旱基因资源的改良是维持林地生产力的关键。近年来，关于杨树miRNA介导的生长和胁迫反应的研究，例如在杨树trichocarpa中的木质部形成，以及在杨树euphratica中对盐胁迫反应的靶标，已取得一定进展。miR6445-NAC029调控轴通过协调谷胱甘肽S-转移酶U23的表达和增强氧化应激缓解系统，提高了杨树的抗旱性。此外，Pto-miR6427通过miR6427和miR6427*调节杨树的抗旱性。尽管miR156-SPL等调控模块已在模式草本植物中得到研究，但在寿命较长的木本植物如杨树中的功能角色、调控机制和生理结果仍需进一步探索。杨树作为具有经济和生态价值的模式树种，为揭示抗旱调控的物种特异性方面提供了独特的生物学背景。本研究旨在表征杨树中的抗旱响应miRNA-mRNA调控网络，重点在于识别新的调控模块并验证其在抗旱适应中的功能角色。本研究使用了由林业科学研究院开发的“中雄”系列的三个新杨树品种，这些品种在抗旱性上表现出显著差异。基于之前对这些差异的生理机制的深入分析，我们进一步研究发现miR156g在耐旱品种ZX4中是干旱诱导的调控因子。功能分析显示，PagSPL1B作为miR156g的直接靶标，起着负向调控抗旱性的作用。通过建立miR156g-PagSPL1B调控通路，我们的研究为杨树抗旱适应的分子基础提供了新的见解，并为培育抗旱性更强的树木提供了有价值的遗传资源。
在实验材料和处理方面，本研究使用了三个杨树品种（ZX3、ZX4、ZX5）来自“中雄”育种计划，由林业科学研究院开发。这些品种因其优良的林业特性，如快速生长和广泛的适应性，以及在抗旱性上的显著差异，成为研究抗旱性关键调控机制的宝贵系统。它们的遗传背景如下：ZX3（Populus deltoides × P. maximowiczii cl. 'Zhongxiong 3'）是一种雄性品种，来源于P. deltoides 'Shanhaiguanensis' × P. deltoides 'Harvard'（母本）和P. maximowiczii 'Henry'（父本）的杂交。ZX4（Populus deltoides × P. suaveolens cl. 'Zhongxiong 4'），也是一种雄性品种，来源于P. deltoides 'Shanhaiguan'（母本）和P. suaveolens（父本）的杂交。ZX5（Populus euramericana cl. 'Zhongxiong 5'）是一种雄性品种，来源于杂交克隆（P. deltoides '55/65' × P. deltoides '2KEN8'）作为母本与P. nigra 'Vereecken'作为父本的杂交。
实验工作于2023年在中国东北林业大学生命科学学院的植物生理研究设施中进行。所有实验植物株系均通过茎段扦插繁殖建立。选择三个具有良好木质化、无病虫害、具有健康且强壮的当年枝条的多年生杨树品种进行实验。茎段从植物中剪下并修剪成3–5 cm长的茎段，每个茎段至少包含两个完全发育的芽。茎段扦插于1:3（体积比）的蛭石：土壤生长基质中，并在温室条件下培养。温室温度维持在25/23°C（光照/黑暗），光周期为16小时光照和8小时黑暗，光照强度设置为400 μmol·m?2·s?1。对于每个杨树品种，选择30株生长一致且发育良好的植株。其中15株接受干旱处理，其余15株则正常灌溉作为对照。每个品种的对照和干旱处理组分别标记为ZX3-CK、ZX3-DT、ZX4-CK、ZX4-DT、ZX5-CK和ZX5-DT。在干旱诱导前，生长基质通过灌溉达到饱和。对照组每三周浇水以维持最佳土壤湿润度，而干旱处理则通过停止浇水来诱导自然干旱胁迫。在七天的干旱处理后，对每个组进行表型观察和拍照。选择七天的干旱处理是因为初步观察表明，这一时间段足以在三个品种中诱导清晰的干旱响应表型和生理变化，同时避免严重组织损伤，这可能会影响后续测序分析的RNA质量。这一时间段也与之前在杨树中评估干旱反应的研究一致。
然后收集叶片样本，用液氮冷冻30分钟，并在-80°C保存以用于sRNA和转录组库的构建。脯氨酸（Pro）含量通过磺基水杨酸-吲哚三酮法测定。叶片的相对含水量（RWC）通过公式（RWC）=（FW?DW）/(TW?DW)×100%计算，其中FW是叶片样本的鲜重，TW是叶片浸泡在蒸馏水中直到饱和后的重量，DW是叶片在65°C烘烤至恒重后的干重。叶片的SPAD值通过CCM-200（OPTI，美国）测定。每种处理的上述生理指标测定三次生物重复，并取平均值进行分析。
在miRNA测序和转录组数据整合分析中，我们对六个处理组（ZX3-CK、ZX4-CK、ZX5-CK、ZX3-DT、ZX4-DT、ZX5-DT）的miRNA进行了表达模式分析。Illumina测序产生了199.52百万对端原始读数，满足每个生物重复的最低阈值10.14百万读数。去除适配器和低质量读数后，剩余156.32百万清洁读数，每个库贡献≥68.23百万读数。皮尔逊相关分析显示三个生物重复之间具有高可重复性，且处理组之间有清晰的分离，确认了sRNA-seq数据集的可靠性。
为了确定miRNA目标基因的表达谱，我们还从同一六个组中准备了mRNA库并进行了RNA-seq，得到121.04 Gb的清洁数据（≥6.18 Gb每样本；Q30>95.04%）。重复间的皮尔逊相关系数≥0.81，表明转录组数据的一致性良好。
miRNA与mRNA数据集的整合分析显示，干旱响应的miRNA和其目标基因是工程抗旱作物的有前景候选者。通过严格的过滤去除低质量读数和适配器污染，最终的miRNA谱系包含386、381、379、361、372和376个独特的序列。这些miRNA的潜在目标基因通过miRBase和表达相关性与RNA-seq数据验证。最终的目标基因集进行了基因本体（GO）和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析，从而识别出干旱响应的miRNA-目标调控模块。
通过使用Cytoscape平台，我们构建了66个在干旱胁迫下发生表达变化的miRNA在ZX4中的共表达网络，以及它们对应的差异表达目标转录因子和功能基因。干旱处理后，ZX4中共有12个显著上调的miRNA和24个显著下调的miRNA，这些miRNA分别靶向28和27个转录因子。值得注意的是，ptc-miR156家族的四个上调成员共同靶向18个SPL转录因子。虽然大多数SPL基因在非胁迫条件下在ZX3中表达增加，但在水分不足条件下，它们的转录本丰度显著低于ZX4和ZX5。例如，SPL8和SPL17在干旱处理后在ZX4中显著上调，而在ZX3和ZX5中则保持不变。在SPL家族成员中，ptrSPL18在ZX4中表现出最高的表达水平，并且在所有三个品种中均比其他SPLs更高度表达。然而，ptrSPL18的表达在所有基因型中在干旱胁迫后显著下调。ptc-miR172家族的四个上调成员共同靶向六个乙烯反应因子（ERF）转录因子。同样，ptc-miR319e和ptc-miR319h靶向Teosinte branched 1、Cycloidea和Proliferating cell factor 2（TCP2），而ptc-miR828a和ptc-miR828b-5p则靶向三个Myeloblastosis（MYB）转录因子。相反，ptc-miR169家族的九个显著下调成员靶向十个核因子Y（NF-Y）转录因子。其中，NF-YA1、NF-YA3、NF-YA10和NF-YA11在干旱处理后在ZX4中显著上调，NF-YA11在ZX5中也表现出上调。在干旱处理后，大多数NF-YA基因在ZX4中上调，而少数则下调。
为了验证测序结果，我们对八种miRNA（包括ptc-miR156g、ptc-miR169z和ptc-miR172d）在三个杨树品种（ZX3、ZX4和ZX5）中的表达进行了qRT-PCR分析。qRT-PCR结果与小RNA测序数据的趋势一致。例如，在干旱胁迫下，耐旱品种ZX4显著上调了ptc-miR156g，而干旱敏感品种ZX3和ZX5则没有显著诱导。这些发现确认了ptc-miR156g的差异诱导与杨树品种间抗旱性的变化有关。此外，我们随机选择了六个差异表达基因进行qRT-PCR验证，结果表明其表达模式与RNA-seq数据一致，支持了转录组数据集的可靠性。
基于加权基因共表达网络分析（WGCNA），我们识别了关键的miRNA-目标基因网络。该研究对18个样本数据集进行了WGCNA，比较了处理前后的转录谱。WGCNA用于构建基因共表达网络，探索模块基因与不同品种之间的关联，并识别与干旱胁迫相关的关键基因。首先，基于基因表达的相关性构建了基因聚类树，并去除了异常值。使用软阈值12，通过动态树切割识别了不同的基因模块。不同颜色代表不同的模块。最终，所有21,249个基因被分为18个功能模块。随后，使用1000个随机选择的基因生成了一个拓扑重叠热图，以展示基因之间的关系。分析不同品种处理前后的模块与处理的关系显示，MEbrown模块在干旱处理前与所有三个品种呈负相关，但在干旱处理后呈正相关。值得注意的是，MEbrown模块与耐旱品种ZX4显示出最强的相关性，表明该模块中的基因可能在干旱胁迫响应中起关键作用。
GO和KEGG富集分析在MEbrown模块的5133个基因上进行。GO富集分析显示，该模块中的基因主要富集在RNA结合、RNA加工和RNA代谢过程中，这些过程都与基因表达调控有关。此外，该模块还富集在与翻译相关的进程中，如蛋白质复合物的组装和细胞氮化合物代谢。KEGG富集分析显示，该模块显著富集在RNA降解（map03018）、mRNA监控通路（map03015）和氨酰基-tRNA生物合成（map00970）等通路中。这些通路与转录和翻译过程以及基础代谢功能密切相关。GO和KEGG富集分析的结果表明，MEbrown模块中的基因主要参与基因表达调控和基础代谢。这一结果与植物在胁迫条件下的基因表达变化一致，并支持了该模块与miRNA之间强功能关系的预期。
进一步，通过维恩分析（
图8f）比较了MEbrown模块中的5133个基因与先前鉴定的miRNA目标基因之间的关系。四个转录因子被发现同时存在于MEbrown模块和miRNA目标基因中：PtrSPL18（Potri.001G058600.v4.1）、PtrNF-YA11（Potri.001G257600.v4.1）、PtrNF-YA3（Potri.001G266000.v4.1）和PtrNAC22（Potri.005G098200.v4.1）。使用Cytoscape软件构建了棕色模块中前2000个高度相关的基因网络（
图S4c），发现PtrSPL18在四个转录因子中具有最高的相关性。结合这三个杨树品种中PtrSPL18在干旱胁迫下的表达变化（
图6a），以及miR156家族的四个miRNA（ptc-miR156g、ptc-miR156h、ptc-miR156i和ptc-miR156j）在耐旱品种ZX4中显著上调（
图4），我们确定PtrSPL18作为调控杨树抗旱适应的关键靶基因。因此，后续研究将进一步对这一枢纽基因进行功能验证。
为了进一步阐明miR156g-SPL模块在抗旱性中的作用，我们鉴定了84K杨树中PtrSPL18的同源物。基于拟南芥、杨树trichocarpa和84K杨树的SPL蛋白序列的系统发育分析（
图9a）显示，PagSPL3A（Pag.A01G000785.v3.1）和PagSPL1B（Pag.B01G000692.v3.1）与PtrSPL18高度同源，其中PagSPL1B与PtrSPL18的序列相似性甚至更高。对84K杨树在不同干旱胁迫水平下的转录组分析显示，PagSPL1B表现出最显著的响应（
图9b），表明其可能在调控抗旱性中起关键作用。ptc-miR156g与PagSPL1B的靶向关系通过实验验证，并通过切割实验确认了PagSPL1B是ptc-miR156g的直接靶标（
图9；
图S6），与我们最初的预测一致（
图6a）。亚细胞定位和转录活性实验表明，PagSPL1B是一种定位于细胞核的转录因子，具有转录激活活性（
图10）。我们生成了过表达PagSPL1B的转基因84K杨树株系（OE-1和OE-2）。表型和生理分析显示，这些株系在干旱胁迫下表现出比野生型（WT）更严重的损害，包括叶片含水量减少和萎蔫加剧。ROS清除指标，如MDA、H?O?和O??的水平在过表达株系中比WT显著升高，而可溶性糖和脯氨酸的积累在转基因株系中显著低于WT。这些结果表明，PagSPL1B的过表达通过增加氧化损伤、抑制渗透调节和加剧PSII和PSI光抑制，降低了84K杨树的抗旱性。这些结果确立了一个清晰的调控通路，即干旱诱导的miR156g通过抑制负向调控因子PagSPL1B来增强抗旱性。PagSPL1B的鉴定不仅推进了我们对木本植物miRNA介导的胁迫调控机制的理解，还为杨树抗旱性遗传改良提供了有前景的分子靶点。
在干旱胁迫下，杨树的叶绿素含量显著下降，而转基因株系表现出更明显的下降。叶绿素a和叶绿素b的含量在过表达株系中比野生型显著减少。此外，干旱胁迫不仅阻碍了水分吸收，导致叶片含水量减少，还抑制了叶绿素合成相关基因的表达，激活了叶绿素降解相关基因，减少了叶绿素合成途径中的关键酶活性，最终导致叶绿素积累减少。在干旱条件下，ZX4的叶片仅表现出轻微的萎蔫，保持了直立的顶芽，而ZX5表现出更明显的萎蔫，ZX3则表现出严重的萎蔫，并在下部叶片中出现明显的黄化（
图1a）。这些对比反应可能反映了它们不同的遗传背景，因为ZX4继承了来自P. suaveolens的抗旱性状，而ZX3由于P. maximowiczii的遗传背景，对水分不足更为敏感，ZX5则表现出中间表型。此外，ZX4通过脯氨酸积累表现出更强的渗透调节，同时更好地维持了相对含水量和叶绿素水平，为其卓越的抗旱性提供了生理基础。
这些表型观察与叶绿素含量和SPAD值的测量结果一致，证实了ZX4在干旱胁迫下保持了相对较高的水分和叶绿素水平。渗透调节物质如可溶性糖和脯氨酸的积累是植物在干旱条件下降低细胞水势以增强水分吸收的关键适应机制。脯氨酸不仅作为渗透调节物质，还作为细胞防御的关键信号分子（
图1c）。在本研究中，耐旱品种ZX4表现出比耐旱敏感品种ZX3显著更高的叶脯氨酸积累。因此，ZX4的渗透调节物质积累可能有助于在干旱条件下改善水分吸收和防止叶绿素降解，这为其卓越的抗旱性奠定了基础。这些发现与我们之前的研究结果一致，表明ZX4在干旱条件下保持了相对高的光合活性。
miRNA（微小RNA）在植物生长、发育和应对环境胁迫方面发挥着关键作用。为了更好地理解三个杨树品种在抗旱性上的差异，我们构建了miRNA和mRNA库，分别在控制和干旱条件下进行分析。测序结果表明，大多数miRNA的长度在20–24个核苷酸之间（
图3a），并且在第一位置有强烈的尿嘧啶偏倚，第十位置有腺嘌呤偏倚（
图3b）。这些特征与之前的研究结果一致，表明测序数据的高质量和可靠性。此外，湿润和干旱处理下鉴定的miRNA类型和数量在三个杨树品种中相似（
图3c），表明植物中miRNA家族的保守性。使用NOIseq进行的差异表达分析揭示了不同杨树品种在干旱胁迫下的miRNA表达模式。在干旱敏感品种ZX3中，大多数DEMIs在干旱胁迫下下调，而干旱耐受品种ZX4和ZX5中，有更多DEMIs在干旱条件下上调（
图4）。这些结果表明，不同杨树品种的miRNA在干旱胁迫下表现出不同的调控反应。因此，miRNA可能是杨树抗旱适应机制差异的关键决定因素。类似模式也在其他植物物种中被报道，包括拟南芥、水稻、玉米和大豆。
miRNA通过与目标mRNA的完美或部分互补性来介导基因沉默，诱导RNA诱导的沉默复合体（RISC）介导的降解。我们预测了差异表达miRNA（DEMIs）的目标基因，并进行了GO和KEGG富集分析（
图5）。结果表明，DEMIs目标基因主要富集在与转录调控相关的GO术语中，如DNA结合，这与已知的miRNA通常靶向转录因子的趋势一致。值得注意的是，一些miRNA靶向非转录因子（
图7），其目标基因显著富集在木质素代谢、氧化还原酶活性和次级代谢物生物合成通路中。这些通路是植物结构适应和应激缓解的关键。例如，木质素生物合成增强了细胞壁，从而在干旱条件下减少水分流失并提高机械抗性。氧化还原酶和次级代谢物则参与ROS清除和渗透调节。KEGG分析表明，干旱处理下显著积累在激素响应通路、MAPK信号和泛素介导的降解中，这些通路在植物对非生物胁迫的反应中起着核心作用。激素合成和信号转导在调控植物对干旱的适应性方面尤为重要。以前的研究表明，miRNA通过调控激素信号来调节干旱耐受性。例如，在干旱胁迫下，水稻中miR1876的过表达降低了DWD活性，从而减少了ABA的产生。在水稻中，miR167通过靶向ARF6和ARF8来影响生长素水平，从而调节根系伸长。赤霉素（GAs）通过miR319介导的靶向TCP转录因子协调植物发育。在本研究中，ptc-miR430在干旱处理下在ZX4中显著下调，而在ZX3和ZX5中上调。EIN2，作为ptc-miR430在乙烯信号通路中的预测目标，表现出相反的表达模式——在ZX4中上调，在ZX3和ZX5中下调，表明存在调控关系。乙烯是一种关键的胁迫相关激素，在植物对非生物胁迫的反应中起着重要作用。以前的研究表明，miR319-PvPCF模块通过促进乙烯生物合成提高了黑麦草的盐胁迫耐受性。干旱条件下ptc-miR430的下调可能缓解了对EIN2的抑制，从而增强了乙烯信号并促进干旱胁迫反应。此外，乙烯受体的激活依赖于铜离子结合（
图7）。这支持了ptc-miR430-EIN2调控模块在杨树干旱反应中起关键作用的假设。
泛素化也被认为是植物对非生物胁迫反应的重要组成部分。泛素-蛋白酶体系统（UPS），主要由E3泛素连接酶介导（
图7），在多种植物物种中被验证在干旱耐受性中的作用。我们的结果表明，ptc-miR1446家族在干旱胁迫后显著下调，靶向CUPIN家族蛋白和E3泛素连接酶。同样，ptc-miR399家族的成员靶向两个泛素降解酶。尽管所有三个品种的E3泛素连接酶在干旱下表达减少，但ZX4的减少不那么显著，并且维持在相对较高的水平。这表明ptc-miR1446介导的泛素化可能有助于增强ZX4的抗旱性。虽然miRNA通常通过抑制其目标基因起作用，但我们观察到目标基因的表达模式并不总是与miRNA水平呈反向相关（
图6，
图7）。例如，在Puccinia striiformis f. sp. tritici race CYR32感染后，tae-miR1432显著上调，其预测目标基因编码钙结合蛋白，也表现出上调（
图S16）。这些发现表明，目标基因的表达受到miRNA之外的多种调控因子的影响，这些调控因子共同构成了一个复杂的调控网络，调控杨树的抗旱性。
调控转录因子（TFs）是miRNA影响植物生长、发育和胁迫反应的主要机制之一。在本研究中，我们鉴定了11个家族的36个miRNA，它们靶向55个转录因子（
图6）。在干旱胁迫下，耐旱品种ZX4中七个miRNA家族的24个成员下调。值得注意的是，ptc-miR169家族的九个成员在ZX4中显著下调（
图6）。除了miR169z在ZX3中上调外，该家族的其他成员在所有三个品种中均下调。miR169是植物中最大的miRNA家族之一，主要靶向NF-YA转录因子，部分成员也靶向NF-YC（
图S21；
图S22）。我们鉴定出九个NF-YA基因作为ptc-miR169的目标。NF-YA3/10/11在所有三个品种的干旱胁迫下均上调，其中在ZX4中上调的倍数最高。NF-YA1/7/8在ZX4和ZX5中上调，但在ZX3中下调。之前的研究表明，ZmNF-YB16的过表达增强了玉米的抗旱性、光合效率、产量和抗氧化能力。同样，miR169o通过靶向PtNF-YA6增强了杨树的抗旱性。NF-Y基因在干旱中的作用也曾在大豆和辣椒中被报道。这些结果表明，miR169-NF-Y调控网络在植物抗旱适应中起着关键作用。miR160通过靶向ARF并调节关键生长素响应转录因子间接调控抗旱性。miR164通过靶向NAC转录因子被报道直接影响抗旱性，这些转录
