微塑料与双酚A协同暴露通过氧化应激加剧大口黑鲈病毒易感性机制研究

《Advanced Biotechnology》：Co-exposure to microplastics and bisphenol A increases viral susceptibility in largemouth bass (Micropterus salmoides) via oxidative stress

本研究针对淡水生态系统中普遍共存的微塑料(MPs)和双酚A(BPA)复合污染问题，通过环境相关浓度暴露实验，首次揭示MPs与BPA协同作用通过抑制NRF2介导的抗氧化信号通路，导致氧化应激、线粒体损伤和细胞凋亡，从而显著提高大口黑鲈对神经坏死病毒(NNV)的易感性。该研究为污染物混合毒性评估提供了新视角，对水产养殖疾病防控具有重要指导意义。

　　

在当今塑料污染日益严重的背景下，微塑料(MPs)和双酚A(BPA)已成为全球淡水生态系统中普遍存在的污染物。这两种污染物因其在环境中的广泛分布和对水生生态系统的潜在风险而备受关注。更令人担忧的是，由于BPA对聚合物表面的强亲和力，它们经常与MPs共同被检测到，形成复合污染。然而，这两种污染物的联合暴露对宿主-病原体相互作用的影响尚不明确，特别是它们如何通过干扰宿主的抗氧化防御系统来影响病毒易感性，成为当前环境毒理学研究的重要空白。

针对这一科学问题，Gao等人在《Advanced Biotechnology》上发表了创新性研究，首次系统揭示了MPs和BPA协同暴露通过破坏氧化应激平衡而增加大口黑鲈病毒易感性的分子机制。该研究不仅为理解污染物混合毒性提供了新见解，也为水产养殖业的可持续发展提供了重要科学依据。

研究人员采用多学科交叉的研究方法，主要包括：通过14天暴露实验评估不同浓度MPs(5-25μg/L)和BPA(50-200ng/L)对大口黑鲈的毒性效应；利用酶活性检测试剂盒分析抗氧化酶(SOD1、CAT、GPx)活性和氧化损伤指标(MDA)；采用qRT-PCR技术检测NRF2信号通路相关基因表达；通过组织化学染色(HE和TUNEL)和透射电镜观察组织病理变化和超微结构；结合分子对接和网络毒理学分析预测污染物与靶点的相互作用；最后通过NNV攻毒实验评估病毒易感性。实验所用大口黑鲈样本来自广州诚毅淡水孵化场。

3.1 环境相关暴露浓度的选择

预实验结果显示，MPs和BPA均呈现剂量依赖性致死效应，其中25μg/L MPs和200ng/L BPA处理组死亡率最高。基于此，研究人员选择了无明显致死效应的10μg/L MPs和100ng/L BPA作为正式实验浓度。荧光显微观察进一步证实，MPs+BPA联合暴露组肝脏中MPs积累量显著高于单一暴露组，且肝脏出现明显肥大现象。

3.2 MPs和BPA引起的抗氧化系统破坏

与对照组相比，MPs、BPA及其联合暴露均显著破坏了大口黑鲈肝脏抗氧化系统。酶活性分析显示，所有处理组的SOD1、CAT和GPx活性均显著降低，其中MPs+BPA组的抑制最为明显。同时，qRT-PCR结果显示SOD1、CAT、GPx1和NRF2的转录水平下调，而Keap1表达显著上调。脂质过氧化标志物MDA含量在暴露组显著升高，在联合暴露组达到峰值。

3.3 肝脏组织病理学和肝功能指标

HE染色显示各暴露组肝脏出现明显的组织病理学改变。对照组和溶剂对照组肝脏结构正常，MPs组出现轻度空泡化和血窦扩张，BPA组呈现肝索紊乱和细胞质变性特征，而MPs+BPA组损伤最为严重，包括广泛空泡化、肝细胞坏死和核固缩。与此一致，各暴露组肝脏ALT和AST水平显著升高，联合暴露组达到最高值。

3.4 肝组织ROS积累

DCFH-DA荧光染色显示，与对照组相比，MPs和BPA组ROS相关红色荧光显著增强，MPs+BPA组信号最强。这一直观证据与生化结果一致，支持了MPs和BPA联合暴露加剧大口黑鲈肝脏氧化应激的观点。

3.5 应激和凋亡信号激活

MPs、BPA及其联合暴露均触发大口黑鲈应激和凋亡信号。HSP70表达在所有暴露组显著上调，联合暴露组达到峰值。促凋亡标志物Bax和Caspase-3表达升高，而抗凋亡基因Bcl-2下调。Caspase-3酶活性也显著增加，联合暴露下诱导最强。TUNEL实验证实肝脏切片中凋亡细胞明显增加，MPs+BPA组最为显著。同时，所有处理组肝脏ATP水平急剧下降，表明能量代谢和细胞稳态受损。

3.6 脑线粒体超微结构改变

透射电镜显示MPs+BPA联合暴露组鱼脑组织出现线粒体异常。主要表现为线粒体肿胀、嵴断裂或紊乱，常伴有空泡变性。相比之下，对照组线粒体膜完整、基质致密、嵴清晰。BPA单独暴露组和MPs单独暴露组也观察到轻微结构改变，但远不如联合暴露组严重。

3.7 BPA与NRF2结合及氧化还原相关信号扰动

分子对接分析表明，BPA与大口黑鲈NRF2蛋白疏水口袋稳定结合，计算亲和力(结合能)为-6.2kcal/mol。介导此相互作用的关键残基包括Tyr33、Asn34、Gln37和Arg36，形成氢键和范德华力，可能破坏NRF2构象并损害其转录激活抗氧化基因的能力。

网络毒理学分析确定了BPA和聚苯乙烯暴露之间有260个重叠基因靶点。这些共享靶点的GO富集分析显示与氧化应激反应、脂质代谢和凋亡调控相关的簇。KEGG通路分析进一步强调了氧化还原相关信号级联的显著富集，包括PI3K-Akt、mTOR和FoxO通路，表明NRF2介导的氧化还原控制汇聚性破坏是MPs+BPA暴露损害细胞抗氧化防御和促进肝细胞损伤的合理机制。

3.8 对NNV感染易感性增加

为了评估MPs和BPA暴露对宿主免疫抵抗力的影响，研究人员在处理14天后对大口黑鲈进行NNV攻毒。转录分析显示，所有暴露组病毒基因标志物(NNV衣壳蛋白CP和RNA依赖性RNA聚合酶RdRp)均显著上调。值得注意的是，MPs+BPA组病毒载量最高，在感染后3天和7天均观察到病毒基因组峰值。

研究结论与意义

本研究揭示了一个机制级联反应：MPs和BPA联合暴露通过氧化应激、生物能量破坏和细胞凋亡损害大口黑鲈的抗病毒防御。这一过程的核心是抗氧化防御主调控因子NRF2信号的抑制，它将这些效应整合成一个统一的毒理学通路，而不是将它们视为孤立的结果。

与单一暴露相比，联合暴露对NRF2及其下游靶点(SOD1、CAT、GPx)产生更强的抑制，表明该通路对复合化学应激的敏感性增强。同时观察到的Keap1上调表明了一种反馈调节机制，在持续氧化应激下限制NRF2核转位。同时，线粒体功能障碍明显，包括ATP耗竭和凋亡激活，表明能量衰竭在细胞死亡中起关键作用。

从生态毒理学角度看，传统评估主要关注单一化学品，而水生生物在自然环境中经常暴露于复杂污染物混合物。本研究考察的MP-BPA联合暴露代表了一个现实的环境情景，特别是在塑料碎片和化学添加剂经常共存淡水养殖系统中。研究结果表明，这种组合可以触发生物学结果(如病毒易感性增加和线粒体功能障碍)，这些结果不能通过单一化合物效应预测，强调需要将当前框架重新定位于基于混合物的毒性评估。

该研究通过整合分子(NRF2抑制)、细胞(氧化应激和凋亡)和个体(NNV易感性)反应，证明了基于AOP推理在解决复杂混合物暴露方面的实用价值。将混合物响应生物标志物(如NRF2抑制、ATP耗竭和病毒易感性)纳入环境监测策略，可以提高生态风险预测的准确性。从管理角度看，这些发现强调迫切需要将混合物毒性和免疫相关生物标志物纳入淡水生态风险评估和水产养殖可持续性框架。