元条形码技术与鸟枪法测序的比较证实了叶绿体rRNA基因在评估湖泊浮游植物群落结构中的重要性

《Molecular Ecology Resources》：Comparison of Metabarcoding and Shotgun Sequencing Confirms the Relevance of Chloroplastic rRNA Genes to Assess Community Structure of Lake Phytoplankton

湖泊浮游植物群落结构分析表明，基于叶绿体16S和23S rRNA基因的代谢组测序与全基因组测序在主要浮游植物门类（蓝藻门、隐藻门、硅藻门、光合型浮游植物门）相对丰度上具有高度一致性，验证了该靶向测序方法在近阿尔卑斯湖泊生态监测中的可靠性。

　　湖泊在生态系统中扮演着重要角色，不仅参与碳循环和气候调节，还为人类提供重要的生态服务。在这些生态系统中，浮游植物（包括光合微生物和蓝藻）是关键的生物组成部分，其多样性及其组成的变化对理解湖泊生态系统的稳定性与功能至关重要。此外，浮游植物的丰富性和快速响应环境变化的能力，使其成为评估湖泊生态质量的重要生物指示器，尤其是在《水框架指令》（WFD）中被广泛应用。因此，准确地表征浮游植物的多样性与丰度，对于理解湖泊生态功能及其对人为压力和气候变化的反应具有重要意义。

传统上，浮游植物的分类主要依赖于光学显微镜技术，如Uterm?hl方法，尽管这种方法目前仍是WFD生物监测的标准方法，但其在捕捉微小浮游植物（如微微型蓝藻和微小的真核藻类）以及隐性多样性方面存在一定的局限性。此外，不同分析者之间在分类上的差异也会影响基于浮游植物的水质评估结果。为了克服这些局限，一种基于高通量测序的遗传条形码方法（即metabarcoding）已被广泛测试并成功应用于微藻生态学研究中。这种方法的优势在于，它能够理论上覆盖整个浮游植物的多样性，无论其大小，并且被认为是一种比显微镜更可靠、更经济、更高效的方法。这些优点使得metabarcoding在研究微藻生态时得到了迅速应用，提高了研究的时间或空间分辨率，并揭示了以前未被发现的多样性。

然而，metabarcoding依赖于一些关键步骤，这些步骤可能影响检测到的分类群数量及其相对丰度。首先，条形码的选择对检测到的多样性有重要影响。在高度多样且多系的浮游植物群体中，找到一个适用于所有目标分类群的单一条形码是具有挑战性的。例如，18S rRNA基因的小型可变区域是最常用的条形码之一，但这种方法无法检测到蓝藻，因此需要使用原核生物的16S rRNA基因进行额外的扩增。此外，某些分类群如甲藻或隐藻可能由于其高度变异的叶绿体rRNA基因或碎片化的叶绿体DNA而无法被这些条形码充分代表。因此，选择合适的条形码对于准确评估浮游植物的组成至关重要。

其次，PCR过程本身也可能引入偏差，影响最终的分类群多样性及其比例。PCR过程中，引物的匹配情况可能导致某些分类群的丰度被错误估计，甚至完全未被扩增。此外，PCR过程可能对某些分类群进行过度或不足扩增，倾向于更好地扩增较短且结构简单的DNA片段。这些因素可能在PCR过程中引入错误，导致扩增序列的误分类和某些浮游植物分类群的高估。因此，了解这些偏差对分类群组成的实际影响，对于提高metabarcoding方法的可靠性至关重要。

为了深入研究这些偏差对浮游植物分类群组成的影响，我们采用了shotgun测序作为参考方法。shotgun测序不同于metabarcoding，它不需要预先扩增，而是对样本中的全部遗传信息进行测序，因此能够更全面地揭示样本中的生物多样性。通过比较shotgun测序和metabarcoding在浮游植物分类群相对丰度上的差异，我们可以更准确地评估PCR步骤可能引入的偏差。此外，我们还开发并验证了一种针对叶绿体rRNA基因的生物信息学分析流程，以确保在比较两种方法时，使用相同的参考数据库进行分类。

在本研究中，我们选取了法国的两个大型阿尔卑斯湖——日内瓦湖和安纳西湖，进行为期一年的月度或双月度采样。每个样本被分为两部分，一部分用于显微镜下的分类和计数，另一部分则用于分子分析。通过使用不同的引物对，我们分别扩增了16S和23S叶绿体rRNA基因，并使用Illumina MiSeq平台进行测序。同时，我们对这些样本进行了shotgun测序，以获取更全面的遗传信息。在shotgun数据中，我们提取了16S和23S的完整rRNA基因，并将其与显微镜数据进行比较。

我们发现，尽管在某些分类群（如绿藻和非硅藻的金藻）中，shotgun测序和metabarcoding在相对丰度上存在一定的差异，但其他主要分类群（如蓝藻、隐藻和硅藻）的相对丰度在两种方法之间保持了一致。这表明所使用的引物在这些分类群的检测上是有效的，并且能够可靠地反映其在湖泊中的组成。然而，对于绿藻和非硅藻金藻，由于其在参考数据库中的代表性不足，以及可能存在的内含子导致的扩增失败，其相对丰度在两种方法之间存在较大差异。这说明，当前的参考数据库在覆盖这些分类群的多样性方面仍存在不足，需要进一步完善。

此外，我们还对两种方法之间的分类群组成进行了多变量分析，以评估它们在揭示浮游植物群落结构上的相似性。结果显示，两种方法在分类群结构上具有显著的一致性，表明metabarcoding在捕捉湖泊浮游植物群落的结构方面是有效的。然而，某些样本之间的箭头长度存在差异，这表明在这些样本中，分类群组成存在一定的偏差。这可能是由于PCR过程中某些分类群的扩增效率较低，或者由于参考数据库的不完整，导致某些分类群未被正确识别。

在讨论部分，我们进一步探讨了这些偏差的可能原因。首先，参考数据库的不完整可能导致某些分类群的遗漏或低估。例如，绿藻和非硅藻金藻的许多分类群在参考数据库中代表性不足，这限制了引物的覆盖范围，导致这些分类群在metabarcoding过程中被低估。其次，叶绿体基因的结构复杂性可能影响其扩增效率。例如，绿藻的叶绿体基因可能含有大量内含子，这可能在PCR过程中导致某些基因无法被有效扩增，从而影响其相对丰度的估计。因此，未来的研究应关注长读长测序技术的应用，如Oxford Nanopore或PacBio，这些技术能够更好地处理含有内含子的基因，提高分类的准确性。

综上所述，本研究通过比较shotgun测序和metabarcoding在两个阿尔卑斯湖中浮游植物分类群相对丰度和组成上的差异，验证了叶绿体rRNA基因在评估浮游植物多样性方面的有效性。尽管存在一定的偏差，尤其是对于绿藻和非硅藻金藻，但总体而言，所使用的引物能够可靠地反映浮游植物的主要分类群组成。这些结果对于湖泊管理具有重要意义，尤其是在开发基于浮游植物组成的生物指数以评估湖泊生态质量方面。未来的研究应继续完善参考数据库，并探索长读长测序技术在浮游植物分类中的应用，以进一步提高分类的准确性。