将一种商业样品提取方案进行调整，以适用于生物安全等级3/4的等离子体代谢组学分析

《Journal of Mass Spectrometry and Advances in the Clinical Lab》：Adapting a commercial sample extraction protocol for biosafety level 3/4 compatible plasma metabolomics analysis

感染性休克代谢组学研究及MPLEx-p180方法优化。本研究通过匹配血浆样本，评估MPLEx有机溶剂提取法联合Biocrates Absolute IDQ p180代谢组学协议在灭活BSL-3/4病原体同时保持代谢物检测效能的可行性。结果显示，氨基酸、甘油磷脂、鞘磷脂及单糖类代谢物在两种方法间相关性良好（R2 0.6-0.97），但MPLEx-p180因样本稀释导致生物胺（0-10%检测率）和长链酰基肉碱（检测率下降50-80%）检测率显著降低。建议采用ComBat算法进行数据调和，以整合不同处理方法结果。

　　这项研究探讨了如何在不破坏样本完整性的情况下，改进用于感染研究的代谢组学分析方法。研究团队针对一个国际性的脓毒症观察性队列中的血浆样本，评估了两种不同的处理方式：一种是使用Biocrates公司开发的Absolute IDQ p180商业代谢组学分析流程，另一种是在该流程中加入了有机溶剂提取步骤（即MPLEx方法），以实现对高风险病原体的灭活。研究的核心目标是评估这两种方法在代谢物检测和浓度测量上的表现差异，并探讨如何通过数据整合策略来克服这些差异，从而提升代谢组学分析在高风险感染研究中的应用价值。

脓毒症是一种由宿主对感染的过度反应引发的多器官功能障碍综合征，其对全球公共卫生和军事医疗系统都构成了重大挑战。它不仅影响患者的健康和生存率，还对军事行动的准备状态和成本产生深远影响。由于脓毒症病情进展迅速，早期诊断至关重要。然而，目前缺乏有效的生物标志物来指导临床决策，使得诊断和治疗面临困难。在资源有限的环境中，例如低收入和中等收入国家（LMICs）的医疗体系、疫情期间的应急场景以及长期野外护理期间，这一问题尤为突出。

传统的代谢组学分析方法通常需要对样本进行特定的预处理，以确保分析结果的准确性和可重复性。Biocrates的Absolute IDQ p180方法是一种广泛使用的代谢组学工具，能够针对不同代谢物类别进行定量分析。然而，该方法要求使用未经处理的样本，这在涉及高风险病原体的研究中存在安全隐患。因此，研究团队引入了MPLEx方法，这是一种经过验证的有机溶剂提取技术，能够有效灭活多种生物安全等级3/4（BSL-3/4）的病原体，同时还能提取代谢物、蛋白质和脂质等成分。

在实验设计中，研究人员从柬埔寨、加纳和美国三个地点招募了40名成年患者，他们均因疑似感染而入院，并符合系统性炎症反应综合征（SIRS）的两个或以上标准。每位患者提供了两份匹配的血浆样本，分别按照标准的p180流程和结合MPLEx方法的流程进行处理。随后，这些样本通过两种不同的质谱分析技术进行检测：一种是用于酰基肉碱、甘油磷脂和单糖的流式注射分析串联质谱（FIA-MS/MS），另一种是用于氨基酸和生物胺的超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）。研究人员还利用统计方法对两种处理方式的结果进行了比较，以评估它们在代谢物检测率和浓度上的差异。

结果显示，两种方法在代谢物的检测和定量上存在显著差异。对于大多数目标氨基酸、甘油磷脂、鞘脂类和单糖来说，两种方法的检测率和浓度测量结果较为一致，相关性也较高（R2值在0.598至0.971之间）。然而，对于某些特定的代谢物类别，如生物胺和不饱和酰基肉碱，MPLEx方法由于引入了更高的样本稀释率，导致检测率下降，部分代谢物的浓度接近检测下限（LLoD），从而影响了分析的准确性。此外，对于一些低丰度的代谢物，例如某些甘油磷脂和鞘脂类，两种方法之间的相关性较低，表明它们在提取效率上存在差异。

研究还指出，MPLEx方法虽然提高了样本的提取效率，但同时也引入了更高的稀释度，这在一定程度上影响了代谢物的浓度。为了弥补这一影响，研究人员在MPLEx处理中使用了更大的样本体积，以部分抵消稀释效应。然而，这种调整并未完全解决浓度变化的问题，特别是在一些低丰度代谢物中。因此，研究团队建议在使用MPLEx方法时，应特别关注代谢物的特定提取效率和检测率，并结合适当的数据整合策略，以确保不同处理方法所得数据的一致性和可比性。

在数据整合方面，研究团队提出了几种可能的解决方案。首先，他们建议使用线性校正方法，即基于两种方法之间的浓度关系进行调整。这种方法适用于部分代谢物，尤其是那些浓度范围在两种方法线性范围内的情况。然而，这种方法可能受到实验条件和方法学差异的影响，因此需要谨慎使用。另一种方法是采用基于贝叶斯的统计调整技术，例如使用R语言中的sva包中的ComBat函数，对数据进行后处理校正。这种方法可以克服线性校正的局限性，适用于那些浓度关系复杂或存在非线性变化的代谢物。通过这种方法，研究团队成功地对部分代谢物进行了校正，使其结果更加一致。然而，仍有部分代谢物由于在MPLEx处理中的检测率较低，需要进一步优化提取方法或采用其他数据处理策略。

总体而言，这项研究为高风险感染研究中代谢组学分析的标准化和安全性提供了新的思路。通过结合MPLEx方法，研究团队不仅实现了对病原体的有效灭活，还保留了大部分代谢物的检测能力，从而提高了分析方法的适用性。然而，研究也指出，这种改进并非没有代价。更高的稀释度可能导致某些代谢物的浓度测量出现偏差，因此需要在方法选择和数据整合方面进行权衡。此外，由于不同代谢物的提取效率和检测率存在差异，研究团队建议在实际应用中，应针对特定代谢物类别进行验证和调整，以确保分析结果的可靠性和一致性。

在军事医学领域，这种改进具有重要的现实意义。军队在执行任务时，经常需要在资源有限或环境恶劣的条件下进行医疗支持。例如，在部署到疾病高发地区时，士兵可能面临多种高风险病原体的感染威胁。传统的代谢组学分析方法可能无法满足这些场景下的安全要求，而MPLEx方法的引入则为解决这一问题提供了可能。通过这种方法，研究人员可以在不破坏样本的情况下，安全地进行代谢物分析，从而为疾病的早期诊断和干预提供科学依据。

从更广泛的角度来看，这项研究的意义不仅限于军事医学。在公共卫生领域，尤其是在资源有限的地区，MPLEx方法的使用可能有助于提升感染研究的效率和安全性。例如，在疫情期间，大量患者需要快速诊断和治疗，而传统的样本处理方法可能无法满足这一需求。通过引入MPLEx方法，研究人员可以在不牺牲分析质量的前提下，确保样本的安全性，从而为大规模流行病学研究提供支持。

此外，这项研究也为代谢组学分析方法的标准化和优化提供了新的方向。由于代谢物的种类繁多，且其化学性质各异，传统的代谢组学方法往往难以满足所有研究需求。因此，研究团队提出了一种灵活的处理方式，即在原有方法的基础上进行调整，以适应不同的研究环境和需求。这种思路不仅适用于高风险感染研究，也可以推广到其他需要样本灭活的领域，如病毒学、细菌学和免疫学研究。

研究还强调了数据整合的重要性。在进行多方法比较时，简单的数据合并可能无法准确反映代谢物的真实浓度，因此需要采用科学的数据处理策略。例如，线性校正和贝叶斯调整方法可以有效地对不同处理方式下的数据进行标准化，从而提高结果的可比性和可靠性。然而，这些方法的适用性取决于代谢物的浓度范围和检测条件，因此需要在实际应用中进行仔细评估和调整。

从方法学的角度来看，这项研究为代谢组学分析提供了一个重要的实践案例。通过将MPLEx方法与Biocrates的Absolute IDQ p180流程相结合，研究人员不仅验证了该方法在高风险感染研究中的可行性，还揭示了不同代谢物类别在两种处理方式下的表现差异。这些发现有助于优化未来的代谢组学研究设计，特别是在涉及病原体灭活和样本处理的场景下。同时，研究也提醒研究人员，在使用不同的样本处理方法时，应充分考虑其对代谢物浓度和检测率的影响，并采取相应的数据整合策略，以确保研究结果的准确性和一致性。

在实际应用中，研究人员可以根据具体的研究需求和样本特性，选择最合适的处理方法。例如，对于某些代谢物类别，如氨基酸和生物胺，MPLEx方法可能在提取效率和检测率方面表现较好，而其他类别，如某些低丰度的酰基肉碱和甘油磷脂，则可能需要更谨慎的处理。此外，研究团队还建议，在使用MPLEx方法时，应结合其他技术手段，如数据校正和重复实验，以进一步提高分析的准确性和可靠性。

最后，这项研究为未来的代谢组学研究提供了重要的参考价值。随着代谢组学技术的不断发展，越来越多的商业分析方法被开发出来，以满足不同研究领域的需求。然而，这些方法在实际应用中仍然面临诸多挑战，例如样本处理的标准化、数据整合的复杂性以及病原体灭活的安全性。通过引入MPLEx方法，研究团队为解决这些问题提供了一个可行的解决方案，同时也为其他研究团队在类似场景下的方法优化提供了借鉴。未来的研究可以进一步探索不同提取方法对代谢物检测的影响，并结合更多的临床数据，以验证这些方法在实际应用中的有效性。