用于海洋浮游动物宏条形码分析的特定分类单元迷你条形码标记的设计与测试

《Metabarcoding & Metagenomics》：?The design and testing of taxon-specific mini-barcode markers for metabarcoding of marine zooplankton

浮游生物元标记法中针对桡足类、磷虾类等代表性不足的问题，本研究设计并测试了特异性迷你COI条形码引物。通过Sliding Window分析确定最优扩增区域，结合引物组扩增，显著提升目标类群检测率（3-5倍），验证其高测序质量（Phred≥30）及低扩增偏差，为海洋生态系统监测提供更全面的工具。

　　DNA metabarcoding技术是一种强大的工具，能够用于追踪海洋浮游动物群落的多样性，这在评估海洋生态系统健康和功能方面具有重要意义。该技术通过从样本中提取DNA，利用特定的基因片段进行高通量测序，并结合数据库比对，从而实现对物种多样性的快速、高通量检测。然而，尽管该技术在许多研究中得到了广泛应用，但其在浮游动物群落中的应用仍面临一些挑战，尤其是在使用“通用”引物时，某些类群的代表性和检测率可能不足。因此，本研究旨在通过设计特定类群的短片段条形码引物，以提高浮游动物样本中关键类群的检测比例和准确性。

### 浮游动物分类与生态意义

浮游动物是海洋生态系统中的重要组成部分，它们在能量流动和物质循环中发挥着关键作用。根据浮游动物的生命周期，可以将其分为两大类：**holoplankton（全浮游动物）**和**meroplankton（暂时性浮游动物）**。全浮游动物是指其整个生命周期都生活在水中，例如 copepods（桡足类）、euphausiids（磷虾类）和 chaetognaths（箭虫类）。而暂时性浮游动物则在生命周期的某一阶段进入浮游生物阶段，如 larval stages of crustaceans（甲壳类动物的幼虫阶段）和某些环节动物。

在研究中，这些类群的浮游动物样本被发现，在传统的DNA条形码分析中经常被低估。这可能是由于使用“通用”COI引物时，对某些类群的扩增效率较低，或者条形码参考库中缺乏足够的序列信息。此外，引物设计不当也可能导致某些类群的扩增失败或特异性不足。因此，为了提高检测的全面性和准确性，研究人员设计了针对这四个主要类群的特定引物，以增强对全浮游动物的识别能力。

### 引物设计与选择

研究人员首先从GenBank和BOLD数据库中下载了多个类群的COI基因序列，包括 copepods（1,910条序列）、euphausiids（130条序列）、chaetognaths（50条序列）和 hydrozoans（808条序列）。这些序列涵盖了多个物种、属和科，旨在确保引物设计的广泛适用性。通过使用滑动窗口分析（SWAN）和构建系统发育树，研究人员识别出每个类群中最具有区分度的COI片段，并据此设计特定引物。

在引物选择过程中，研究人员使用了多种指标来评估其性能。其中包括：
1. **K2P距离**：衡量物种间遗传差异的大小，较高的K2P距离通常意味着更高的物种区分度。
2. **零非同种距离**：指同一物种内不同个体之间的遗传距离，较低的零非同种距离表明序列在同种内的变化较小，从而有助于识别物种。
3. **NJ树与参考树的相似性**：通过比较系统发育树的拓扑结构和分支长度，评估特定引物是否能够准确地反映类群间的演化关系。

最终，研究人员选择了不同长度的COI片段，作为潜在的条形码区域。对于copepods，选择的片段长度为120–140 bp；对于euphausiids，选择的片段长度为100–140 bp；对于chaetognaths，选择的片段长度为100–130 bp；而对于hydrozoans，选择的片段长度为220–300 bp。这些区域在系统发育树上的表现优于更长的片段，尤其是在区分物种和减少非特异性扩增方面。

### 引物性能测试

为了验证新设计的引物是否优于传统的“通用”COI引物，研究人员进行了Sanger测序实验。他们从四个类群中选取了多个样本，分别使用新的特定引物和传统的通用引物进行扩增，并比较了扩增效率和序列质量。结果显示，新设计的引物在多个方面表现出色，包括更高的扩增成功率和更高质量的序列数据。

此外，研究人员还通过Phred质量评分来评估序列的可靠性。Phred评分越高，表示序列的准确性越高。在测试中，新引物生成的序列质量明显优于传统的COI和miniCOI引物，这表明它们能够更有效地捕获高质量的DNA信息。这一发现对于提高浮游动物的分类精度和减少假阴性结果具有重要意义。

### 浮游动物样本的高通量测序与物种识别

研究人员利用Illumina MiSeq平台对四种浮游动物样本进行了高通量测序。通过DADA2算法对测序数据进行处理，研究人员成功地去除了嵌合体、过滤低质量序列，并将双端测序数据合并为扩增序列变异（ASVs）。这些ASVs随后被比对到BOLD和GenBank数据库，以确认其对应的具体物种。

在比对过程中，研究人员使用了97%的序列相似性作为阈值，确保每个ASV都能被准确归类。结果显示，使用特定引物的样本中，浮游动物的物种丰富度显著提高。例如，copepods（桡足类）和 euphausiids（磷虾类）的物种比例从之前的10%提升到了36%和11%，而 chaetognaths（箭虫类）和 hydrozoans（水母类）的比例也分别从1%和3%提升到了5%和10%。这一结果表明，特定引物的使用显著提高了这些类群的检测率，从而更全面地反映了浮游动物的多样性。

### 物种丰富度与相对生物量分析

通过比较不同样本的读数（read counts）和物种比例，研究人员发现，copepods和 euphausiids在样本中的相对生物量占主导地位。这一结果与它们在海洋生态系统中的重要性相符，因为这些类群通常数量庞大，且个体体积较大，因此在生物量和生态功能上占据重要地位。然而，值得注意的是，这一结果应被视为一种指示性数据，而非绝对的定量估计，因为读数可能受到引物偏好、DNA降解和提取效率等因素的影响。

此外，研究人员还分析了不同类群在样本中的相对丰度。结果显示，使用特定引物的样本中，copepods和 euphausiids的读数占比较高，而其他类群如 molluscs（软体动物）和 decapods（十足类）的读数则相对较低。这表明，尽管这些类群在生态系统中具有重要的生态功能，但在当前的浮游动物检测中，其代表性仍不足。因此，为了更全面地评估海洋生态系统的多样性，需要结合通用引物和特定引物的混合策略。

### 引物组合的应用与效果

在实际应用中，研究人员采用了特定引物与通用引物的混合策略，即“primer cocktails”。这种策略通过结合不同类群的特定引物和通用引物，提高了整体的物种识别能力。例如，在混合样本中，copepods、euphausiids、chaetognaths和 hydrozoans的物种比例显著提高，分别增加了3到5倍。这一结果表明，特定引物的使用可以有效弥补通用引物在某些类群中的不足，从而实现更全面的浮游动物多样性评估。

### 研究的意义与未来展望

本研究的结果对于海洋生态学和生物多样性监测具有重要意义。通过设计和测试特定类群的条形码引物，研究人员不仅提高了对某些重要浮游动物类群的检测能力，还为未来的大规模浮游动物调查提供了更可靠的工具。此外，研究还强调了结合通用引物和特定引物的重要性，以确保不同类群的检测率和物种丰富度的全面性。

在未来的研究中，可以进一步探索特定引物在不同地理区域和生态系统中的适用性，以及它们对不同环境条件（如温度、盐度和污染水平）的响应。此外，随着DNA条形码数据库的不断完善，特定引物的设计和优化也将变得更加精准和高效。这将有助于提高浮游动物监测的准确性和可靠性，从而更好地理解海洋生态系统的动态变化和生物多样性状况。

### 研究的局限性与挑战

尽管本研究取得了显著进展，但仍存在一些局限性。首先，尽管特定引物能够提高某些类群的检测率，但它们的使用仍然受到数据库覆盖范围的限制。如果某些类群的参考序列不完整，特定引物可能无法准确识别所有物种。其次，引物的特异性仍然是一个挑战，尤其是在处理复杂样本时，可能会出现非特异性扩增或误判的情况。因此，未来的研究需要进一步优化引物设计，并扩大参考数据库的覆盖范围，以提高检测的准确性和全面性。

此外，DNA提取和测序过程中的技术因素也可能影响结果。例如，DNA降解、样本处理方式和测序平台的性能都会对最终的物种识别产生影响。因此，为了确保研究结果的可靠性，需要在实验设计中充分考虑这些因素，并采取相应的优化措施。

### 结论

本研究通过设计和测试特定类群的DNA条形码引物，显著提高了浮游动物样本中关键类群的检测比例和物种丰富度。这种混合使用特定引物和通用引物的策略，为更全面地评估海洋生态系统的生物多样性提供了新的方法。同时，研究还强调了DNA条形码技术在生态监测和气候变化研究中的重要性，以及其在提升物种识别精度方面的潜力。未来的研究应继续探索和优化特定引物的应用，以进一步提高浮游动物监测的准确性和全面性，为海洋生态保护和可持续管理提供科学支持。