基于流式细胞术的可溶性生物标志物检测方法的验证

《Practical Laboratory Medicine》：Flow cytometry-based validation of soluble biomarker detection

可溶性免疫标志物sCD25/sCD40L/sCD130/sTREM-1的流式细胞术多联检测方法在BD FACSLyric平台验证，该方法灵敏度达9.77-219.73 pg/ml，内/间重复系数5-10%，临床样本检测显示sCD25、sCD40L、sTREM-1在肺癌患者显著升高（p<0.001），sCD130降低，四联模型AUC达0.95。

　　这项研究主要围绕一种基于流式细胞术的多重检测方法，旨在同时测量四种可溶性标志物——sCD25、sCD40L、sCD130和sTREM-1在血清样本中的水平。这些标志物在免疫反应和炎症性疾病中扮演着重要角色，特别是在癌症的诊断和治疗评估方面。通过使用BD FACSLyric流式细胞仪，研究人员开发并验证了一种高效的检测方案，使得能够在单一样本中同时获取多个可溶性蛋白的信息，从而提高了检测效率和数据的可靠性。

研究的核心目标是确保这种多重检测方法在实际应用中具备高灵敏度和可重复性。为了实现这一目标，研究团队采用了基于微珠的免疫检测套件，该套件能够与BD FACSLyric流式细胞仪兼容，实现对这些可溶性标志物的精准识别。此外，实验过程中还进行了详尽的样本制备、微珠结合以及检测优化，以确保最终数据的准确性和一致性。数据采集阶段，研究人员记录了至少10,000个事件，以确保数据的统计学可靠性。

为了验证该检测方法的准确性，研究团队根据YYT1589-2018标准，对两个不同浓度级别的模拟样本进行了测试。结果显示，所有四个标志物的相对偏差均在±15%以内，符合检测要求。同时，为了评估方法的可重复性，研究人员按照WS/T 492–2016标准，对样本进行了五天的重复检测，并计算了组内和组间变异系数（CVs）。结果显示，CV值在5%到10%之间，表明该方法在不同实验条件下依然保持了良好的一致性。

参考范围的验证也是研究的重要组成部分。根据WST402-2012标准，研究团队对20名健康个体的血清样本进行了检测，并计算了数据范围（R值）。所有R值均大于90%，表明参考范围的有效性。通过这一验证过程，研究人员确保了检测方法在临床应用中的适用性，能够为疾病的诊断和治疗提供可靠的依据。

此外，研究团队还使用了ROC曲线分析，以评估这些可溶性标志物在肺癌患者和健康人群中的诊断价值。结果显示，sCD25、sCD130和sCD40L的AUC值分别为0.82、0.78和0.75，表明这些标志物在肺癌的诊断中具有较高的准确性。而sTREM-1的AUC值虽然较低，但仍然显示了一定的诊断潜力。通过构建多标志物组合模型，研究人员进一步提升了诊断的敏感性和特异性，其中AUC值达到了0.95，显示出极高的诊断价值。

值得注意的是，研究还发现，在肺癌患者中，sCD25和sCD40L的水平显著高于健康个体，而sCD130的水平则明显低于健康人群。sTREM-1的水平在肺癌患者中也有所升高，但其变化趋势与健康个体之间的差异未达到统计学显著性。这一结果提示，这些标志物可能在肺癌的免疫状态评估中发挥重要作用，尤其是在反映免疫系统的激活状态和炎症反应方面。

sCD25是白细胞介素-2受体α（IL-2Rα）的可溶性形式，其水平的升高通常与免疫系统的过度激活有关。在肺癌患者中，肿瘤细胞的存在可能导致免疫细胞的持续激活，从而促进sCD25的释放。同时，肿瘤微环境中的细胞因子和趋化因子变化也可能进一步增加sCD25的水平，进而影响患者的T细胞免疫功能。

sCD40L主要由T淋巴细胞和血小板表达，是免疫调节中的关键分子。在肺癌患者中，肿瘤细胞可能通过多种机制影响T细胞的激活和功能，从而导致sCD40L的释放增加。例如，肿瘤细胞可能通过分泌特定的细胞因子或与T细胞直接相互作用，来促进sCD40L的表达和释放。这些变化可能与肺癌患者的免疫状态和疾病进展密切相关。

sTREM-1是感染相关炎症标志物，其水平的升高通常与细菌感染有关。肺癌患者由于免疫功能下降，容易发生感染，特别是肺部感染。因此，sTREM-1的升高可能反映了感染的存在或加重，同时也可能与肺癌本身的炎症反应有关。sTREM-1的增加可能在一定程度上抑制了炎症反应，这为理解其在疾病中的作用提供了新的视角。

sCD130则是白细胞介素-6受体的可溶性形式，作为免疫反应和炎症过程中的负调控因子。在肺癌患者中，sCD130的水平显著降低，这可能与肿瘤微环境中细胞因子网络的失衡有关。例如，肿瘤细胞可能分泌某些抑制性细胞因子，影响免疫细胞的功能，从而导致sCD130的表达和释放减少。这一发现提示，sCD130可能在肺癌的免疫调节过程中起到关键作用。

研究团队还采用了详细的门控策略，以确保数据的准确性和可靠性。首先，通过FSC-A与SSC-A的散点图区分微珠群体，排除背景噪声和碎片。随后，使用FSC-A与FSC-H的散点图选择单个微珠，避免聚集带来的干扰。在每个门控的微珠群体中，通过PE-A与APC-A的散点图进一步区分不同的可溶性标志物信号。最终，通过APC-A的直方图进行定量分析。这种门控策略不仅提高了检测的准确性，还增强了实验的可重复性。

在数据处理方面，研究团队使用了GraphPad Prism 9.5和SPSS软件进行统计分析。对于正常性检验，采用Wilcoxon-Mann-Whitney检验，因为数据不满足正态分布。结果显示，sCD25、sCD130和sCD40L在肺癌患者和健康人群中的差异具有统计学意义，而sTREM-1的差异则未达到显著水平。这表明，前三种标志物在肺癌的诊断中具有更高的临床价值。

尽管该多重检测方法在性能上表现出色，但研究也指出了其局限性。例如，sCD130的检测限相对较高，为291.73 pg/ml。然而，研究团队指出，在健康个体中，sCD130的水平通常高于这一阈值，因此即使在低浓度情况下，该方法仍然能够准确识别肺癌相关的标志物。此外，样本的制备和处理需要特别优化，以避免非特异性结合和信号重叠，特别是在复杂的血清基质中。

总的来说，这项研究为肺癌的诊断和治疗提供了新的思路。通过同时检测多个可溶性标志物，该方法不仅提高了检测效率，还为临床医生提供了更全面的免疫状态评估信息。未来，研究团队计划进一步扩展该检测方法，包括增加更多的可溶性标志物或适应其他生物液体，以提升其在不同疾病环境中的适用性。同时，结合先进的治疗平台，该方法有望在肿瘤的诊断和治疗中发挥更大的作用。