利用直流电压偏置（DCVJ）技术监测微藻膜流动性

《Algal Research》：Microalgal membrane fluidity monitoring using DCVJ

微藻膜流动性通过DCVJ探针结合流式细胞术监测，优化条件为1 mL样本浓度1×10? cells/mL，10 μL 10 mM DCVJ孵育20分钟黑暗环境，验证了高渗条件下膜流动性变化及复水性。

　　### 微藻膜流动性监测方法的优化与应用

微藻作为一类古老的生物，自远古海洋中诞生以来，逐渐扩展到地球的各个角落。它们的适应能力令人惊叹，能够在极端环境中生存，例如沙漠、火山喷发的水体以及冰川等。微藻不仅在维持地球大气氧气含量方面发挥着重要作用，还支持了水生食物链的高层结构。然而，它们的潜力远不止于此。在生物技术领域，微藻被视为推动社会向生物基和可持续发展方向转变的重要工具。而在生态学研究中，它们对环境的敏感性使它们成为研究生态系统变化的先进生物传感器。

微藻的细胞膜是其生存和适应环境的关键结构之一。细胞膜不仅保护细胞免受外界环境的影响，还控制水溶性分子的进出。其双分子层结构决定了膜的流动性，而膜的流动性又与细胞的生理状态密切相关。当细胞受到外界压力时，如温度变化、渗透压波动或其他化学物质的刺激，膜的流动性会发生显著变化。例如，过低的温度或过高的渗透压会导致膜从液态晶体状态转变为凝胶状态，从而影响细胞的正常功能，甚至导致细胞死亡。因此，维持适当的膜流动性对于细胞的存活和适应至关重要。

为了直接测量微藻细胞膜的流动性，研究人员开发了一种基于流式细胞术的方法，使用了一种名为DCVJ（9-(2,2-DiCyanoVinyl)Julolidine）的分子探针。DCVJ是一种可溶于甲醇的分子旋转探针，能够插入到细胞膜中。这种方法的核心在于，通过测量DCVJ在细胞膜中的旋转特性，可以间接反映膜的流动性。DCVJ在液态环境中能够自由旋转，而在高粘度或低流动性环境中，其旋转受到限制，导致荧光信号的变化。这种变化可以用于评估细胞膜的流动性。

然而，直接测量膜流动性并非易事。首先，探针的引入需要精确的条件控制，包括细胞与探针的比例、孵化时间、甲醇的使用量等。其次，由于微藻群体中个体的反应可能不同，因此需要对每个细胞进行单独的检测。这正是流式细胞术的优势所在。流式细胞术结合了流体动力学聚焦和光学电子技术，能够将细胞逐个引导通过激光束，从而实现对单个细胞的高通量检测。通过分析细胞与探针之间的荧光信号，研究人员可以获取关于膜流动性的详细信息。

在本研究中，使用了Chlorella vulgaris作为模型微藻，并对DCVJ的标记过程进行了优化。优化后的最佳孵化条件为：1 mL的样品体积，细胞浓度为1 MCell/mL，探针添加量为10 μL，浓度为10 mM，孵化时间为20分钟，并在黑暗中进行。此外，研究还发现，即使在某些参数发生改变的情况下，如细胞浓度降低至0.1 MCell/mL、孵化时间延长至30分钟、甲醇用量增加四倍，信号仍保持稳定，说明该方法具有一定的鲁棒性。这一发现为后续实验提供了更多的灵活性。

在实验过程中，研究人员还考虑了甲醇对细胞膜的影响。虽然甲醇能够帮助探针更好地进入细胞膜，但过高的浓度可能导致膜结构的破坏，进而影响细胞的正常功能。因此，确定了甲醇的最大可接受浓度为50 μL或更少，以确保探针信号的稳定性和细胞的完整性。此外，研究还发现，DCVJ的加入会对膜的荧光信号产生影响，这可能是因为探针改变了膜的物理特性。因此，为了准确评估膜流动性，需要引入一种信号校正方法，以区分探针和背景信号的影响。

在信号处理方面，研究人员采用了一种基于Cohen’s d指数的统计方法，用于比较不同条件下的膜流动性变化。Cohen’s d指数能够有效评估两个群体之间的相似性，而不会受到样本数量的影响。这使得即使在大量数据的情况下，也能准确判断膜流动性是否发生了显著变化。此外，通过将荧光信号与参考值进行比较，研究人员能够计算出相对膜流动性。这种方法不仅提高了数据的准确性，还增强了实验结果的可解释性。

实验验证部分显示，该方法能够成功监测微藻在高渗透压条件下的膜适应过程及其逆转。在实验中，研究人员通过将细胞从低渗透压环境转移到高渗透压环境，观察到了膜流动性的显著变化。随后，随着细胞的生长和葡萄糖的消耗，渗透压逐渐降低，膜流动性也随之恢复。这一过程的动态变化被清晰地记录下来，证明了DCVJ标记方法在实际应用中的有效性。

总的来说，这项研究提出了一种基于流式细胞术的微藻膜流动性监测方法。通过优化探针标记条件和引入先进的信号处理技术，研究人员成功实现了对细胞膜流动性的直接测量。该方法不仅具有较高的灵敏度和可重复性，还能够区分不同细胞群体之间的差异，为微藻在极端环境下的适应机制提供了新的研究视角。此外，该方法的鲁棒性使其在实际应用中具有广泛的前景，为生态毒理学和生物技术领域提供了重要的工具支持。